科普-超分辨顯微成像之多波長(cháng)合束激光器

曾經(jīng)有這樣一個(gè)傳言，“中國的*長(cháng)城是太空中能看到的地球上的人工建筑”，這讓我們中國人自豪無(wú)比。但神舟載人飛船上天后，包括楊利偉、劉洋在內的眾多航天員都曾說(shuō)過(guò)，“沒(méi)有看到長(cháng)城”，這是為何呢？

長(cháng)城

其實(shí)人眼的分辨率很有限，只有0.3角分左右，即便在二百公里左右的近地點(diǎn)軌道高度上，不考慮任何天氣因素，人眼至多看清17米以上的目標，因此對于寬度不過(guò)七八米的長(cháng)城，確實(shí)有心無(wú)力了。當然了，若是不考慮“看清”，而只是“看到”，那么只要在夜間將長(cháng)城照的燈火通明，太空中的宇航員就有可能“看到”長(cháng)城了。不過(guò)這就像遠遠看到商店的霓虹燈箱，卻看不清楚燈箱的字一樣，不屬于我們此處討論的范疇。

200公里左右太空看長(cháng)城效果示意圖

成像系統的分辨率之所以會(huì )受到限制，除了光學(xué)元件存在像差之外，更重要的原因是光波存在衍射效應，使得一個(gè)理想無(wú)限小的點(diǎn)物體發(fā)射的光波通過(guò)系統成像后，由于成像系統口徑有限，物體光的高頻成分被阻擋，終參與成像的只有物體光波的低頻成分（因此傳統成像系統本質(zhì)上相當于一個(gè)低通濾波器），使得終的像不再是一個(gè)無(wú)限小的理想點(diǎn)，而成為了一個(gè)彌散的亮斑，稱(chēng)為“艾里斑”。
 

因此當兩個(gè)點(diǎn)物體距離較近時(shí)，它們通過(guò)成像系統后形成的兩個(gè)艾里斑就會(huì )重疊到一起無(wú)法分辨，兩個(gè)物點(diǎn)恰能分辨的距離就是極限分辨距離，對應的張角即為極限分辨角，這就是的“瑞利判據”?？茖W(xué)家發(fā)現，通常情況下該極限分辨率與光的波長(cháng)（λ）、成像系統口徑（D）和數值孔徑（NA）等參數有關(guān)。

瑞利判據

為了獲得更好的成像效果，科學(xué)家嘗試了許許多多的方法：在光刻系統中使用越來(lái)越短的光波（如目前因特爾等芯片企業(yè)已開(kāi)始使用極紫外光），擴大成像系統口徑（如天文望遠鏡口徑已達到10米以上），增加成像系統數值孔徑（如顯微成像系統使用浸油等方式獲得更大的NA）等，但這些方法都未能擺脫理論極限的影響。
 

“衍射極限”仿佛是一片籠罩在頭頂的陰霾，成為了看似堅不可摧的障礙。為了能夠打破這個(gè)枷鎖和桎梏，實(shí)現超分辨成像，科學(xué)家們真是腦洞大開(kāi)，展現出了無(wú)窮的智慧。

讓我們看看科學(xué)家們通過(guò)哪些方法打破桎梏：
結構光照明顯微(SIM)
普通光學(xué)顯微鏡的成像過(guò)程可以通過(guò)點(diǎn)擴展函數進(jìn)行描述，通過(guò)對點(diǎn)擴展函數進(jìn)行傅里葉變換，可獲得顯微系統的光學(xué)傳遞函數。由于衍射極限的存在，光學(xué)傳遞函數限制了通過(guò)顯微系統的信息量，只允許低頻信息通過(guò)系統，濾除代表細節的高頻信息，即限制了系統的分辨率。
 

結構光照明顯微鏡實(shí)現超分辨的原理，就是利用特定結構的照明光 在成像過(guò)程把位于光學(xué)傳遞函數范圍外的一部分信息轉移到范圍內，利用特定算法將范圍內的高頻信息移動(dòng)到原始位置，從而擴展通過(guò)顯微系統的樣品頻域信息，使得重構圖像的分辨率超越衍射極限的限制。
 

對于光學(xué)顯微鏡系統，光學(xué)傳遞函數的三維結構是圓環(huán)結構，在零頻位置存在凹陷。凹陷帶來(lái)的后果就是CCD 上記錄的信息不僅包含物鏡焦平面上的樣品信息，同時(shí)包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息的干擾，常規熒光顯微鏡無(wú)法獲得層析圖像。三維結構光照明顯微鏡提高分辨率、獲得層析圖像的原理，就是利用特定結構的照明光來(lái)獲得樣品的高頻信息，采用特定算法在橫向和縱向上擴展樣品頻域信息的同時(shí)彌補凹陷帶來(lái)的影響。

飽和結構照明顯微鏡(SSIM)的原理

法國OXXIUS多波長(cháng)合束激光器應用在Nikon顯微鏡

受激發(fā)射損耗顯微（STED）

在STED顯微術(shù)中，有效熒光發(fā)光面積的減小是通過(guò)受激發(fā)射效應來(lái)實(shí)現的。一個(gè)典型的STED顯微系統中需要兩束照明光，其中一束為激發(fā)光，另外一束為損耗光。當激發(fā)光的照射使得其衍射斑范圍內的熒光分子被激發(fā)，其中的 電子躍遷到激發(fā)態(tài)后，損耗光使得部分處于激發(fā)光斑外圍的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，其余位于激發(fā)光斑中心的被激發(fā)電子則不受損耗光的影響，繼續以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。

由于在受激發(fā)射過(guò)程中所發(fā)出的熒光和自發(fā)熒光的波長(cháng)及傳播方向均不同，因此真正被探測器所接受到的光子均是由位于激發(fā)光斑中心部分的熒光樣品通過(guò)自發(fā)熒光方式產(chǎn)生的。由此，有效熒光的發(fā)光面積得以減小，從而提高了系統的分辨率。STED顯微術(shù)能實(shí)現超分辨的另一個(gè)關(guān)鍵在于受激發(fā)射與自發(fā)熒光相互競爭中的非線(xiàn)性效應。

當損耗光照射在激發(fā)光斑的邊緣位置使得該處樣品中的電子發(fā)生受激發(fā)射作用時(shí)，部分電子不可避免地仍然會(huì )以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。然而當損耗光的強度超過(guò)某一閾值之后，受激發(fā)射過(guò)程將出現飽和，此時(shí)以受激發(fā)射方式回到基態(tài)的電子將占絕大多數，而以自發(fā)熒光方式回到基態(tài)的電子則可以忽略不計。因此，通過(guò)增大損耗光的強度，使得激發(fā)光斑范圍內更多范圍的自發(fā)熒光被抑制，可以提高STED顯微術(shù)的分辨率。

受激發(fā)射損耗(STED)顯微的原理

法國OXXIUS公司多波長(cháng)合束激光器

STORM和PALM超分辨顯微成像技術(shù)

STORM技術(shù)中，使用Cy3和Cy5分子對作為熒光標記實(shí)現超分辨成像，因為不同波長(cháng)光可以控制Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色633nm激光可以激活Cy5發(fā)射熒光，同時(shí)長(cháng)時(shí)間照射可以將Cy5分子轉換成暗態(tài)不發(fā)光。之后用綠色的532nm激光照射Cy5分子時(shí)，可以將其從暗態(tài)轉換成熒光態(tài)，而此過(guò)程的長(cháng)短依賴(lài)于第二個(gè)熒光分子Cy3和Cy5之間的距離，因此，當Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對時(shí)，具備了特定的激發(fā)光轉換熒光分子發(fā)射波長(cháng)的特性。

在顯微觀(guān)察前，首先將待測觀(guān)察樣品用染劑染色，將Cy3和Cy5分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來(lái)標記細胞的內源蛋白，然后用波長(cháng)為633nm的紅光長(cháng)時(shí)間照射樣品使Cy5發(fā)射熒光后全部轉化為暗態(tài)，采用波長(cháng)為532nm的綠光激發(fā)Cy3，從而使Cy5處于熒光態(tài)。激發(fā)過(guò)程中應使532nm綠光強度足夠低，以保證在衍射極限范圍內至多只有一個(gè)Cy5熒光分子被激活至熒光態(tài)。而后，用波長(cháng)為633nm的紅色激光照射待觀(guān)察樣品，使處于熒光態(tài)的Cy5分子發(fā)射熒光。通過(guò)電子相機讀取熒光圖像，采用函數擬合的方法對圖像進(jìn)行處理，進(jìn)而確定每個(gè)熒光點(diǎn)的中心位置。經(jīng)過(guò)足夠多次數循環(huán)后對獲得的熒光點(diǎn)位置進(jìn)行疊加，終得到超分辨顯微圖像。

STORM技術(shù)中熒光開(kāi)關(guān)原理圖

PALM技術(shù)中，使用GFP突變體作為光活化蛋白（PA-GFP）來(lái)標記靶蛋白，并在細胞中表達。用405nm激光器低能量照射細胞表面，一次僅激活出稀疏分布的幾個(gè)熒光分子，然后用561nm激光激發(fā)得到熒光，通過(guò)高斯擬合來(lái)定位這些熒光分子，在確定這些分子的位置后，長(cháng)時(shí)間使用561nm激光來(lái)漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子后，使他們不能夠被下一輪的激光再激活出來(lái)。

再分別用405nm和561nm激光來(lái)激活、激發(fā)和漂白其他熒光分子，多次成像后，將這些分子的熒光圖像合成到一張圖上，得到了比傳統光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上的分辨率。PALM顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來(lái)說(shuō)可以達到1nm的數量級。PALM的成像方法只能用來(lái)觀(guān)察外源表達的蛋白質(zhì)，而對于分辨細胞內源蛋白質(zhì)的定位無(wú)能為力。

STROM與PALM的基本原理一致，區別在于STORM使用的熒光開(kāi)關(guān)基團是有機熒光分子對，而PALM使用的熒光開(kāi)關(guān)基團是熒光蛋白分子，由于STORM具有對細胞內源性生物分子成像的優(yōu)勢，目前STORM在活細胞等生物體系的應用更加廣泛。在空間分辨率上，STORM可以達到10-20nm，PALM可以達到20-30nm；在時(shí)間分辨率上，STORM可以達到1s，而PALM約為30s。

STORM與常規顯微成像方法對細胞內微管成像效果對比
 

什么是多波長(cháng)合束激光器？

合束激光器就是將多個(gè)波長(cháng)光合束到一起輸出，它把合束/分束、透鏡、整形器件等全部集成并做了穩固性的設計，各波長(cháng)獨立控制?？梢宰尶蒲泄ぷ髡呋蚬こ處焸儗?zhuān)心于試驗部分而不是做復雜的光路調節

傳統合束光路

OXXIUS合束激光器內部光路設計

OXXIUS合束激光器都有啥干貨？

多8波長(cháng)輸出~緊湊合理的尺寸~高穩定輸出功率~高光束質(zhì)量~高速調制功能~強大智能性….
L4Cc是一款緊湊型多波長(cháng)合束激光器（通用型激光引擎），它可將8個(gè)不同波長(cháng)的激光耦合到一根單?；虮Ｆ饫w之中輸出，能同時(shí)或單獨對每一路激光進(jìn)行控制，單波長(cháng)功率可達300mW。此外OXXIUS可根據客戶(hù)不同的要求進(jìn)行量身定制化的服務(wù)。同時(shí)我們具有遠程診斷修復和自我保護功能，同時(shí)具有通過(guò)USB和RS232接口進(jìn)行軟件控制。激光器可進(jìn)行高速模擬調制或TTL調制。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
客戶(hù)可以自由選擇合束激光的數量（2個(gè)到 8個(gè)波長(cháng)可選）
自由空間光輸出/各種光纖耦合輸出可選；
單光路或多光路輸出
智能性強（遠程診斷修復和自我保護功能）；
軟件控制（通過(guò)USB和RS232接口）
高穩定性，光束質(zhì)量高，噪聲低；
百MHZ的TTL調制功能和模擬調制；
結構緊湊，堅固耐用；
可根據客戶(hù)的要求定制，不收取定制費；
高性?xún)r(jià)比;

主要應用：超分辨率成像、共聚焦顯微鏡、熒光激發(fā)、流式細胞儀、SPIM、FRAP、TIRF……
 

典型波長(cháng)參數：

OXXIUS合束激光器家族部分解決方案：

（單光路輸出）                                      （雙光路輸出）

（8波長(cháng)四光路輸出）                       （6波長(cháng)可插拔光纖輸出）

OXXIUS公司其它激光器: