雙光子顯微成像用飛秒激光器

雙光子激發(fā)熒光（TPEF）顯微鏡，也稱(chēng)為雙光子顯微鏡，是對活體組織深層三維成像的方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢，它使用了更長(cháng)的激發(fā)波長(cháng)（通常是近紅外波段），因而其帶來(lái)的散射比傳統共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見(jiàn)波長(cháng)更少。更長(cháng)的波長(cháng)同時(shí)也減少了來(lái)自散射光的背景照明，并增加了在更高深度處的對比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內大腦圖像。

在熒光顯微鏡中，當兩個(gè)獨立的光子被一種介質(zhì)同時(shí)吸收時(shí)，就會(huì )發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個(gè)合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時(shí)間和空間上同時(shí)重合；通常來(lái)說(shuō)這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當然光子通量越大， 雙光子同時(shí)被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會(huì )帶來(lái)更高的效率，從而帶來(lái)圖像質(zhì)量和分辨率的提升。

在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過(guò)寬波段可調諧的鈦寶石飛秒激光器實(shí)現的，激光器典型規格脈寬為100fs，重復頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來(lái)非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率（在1~4瓦范圍內）會(huì )由于激發(fā)波長(cháng)的線(xiàn)性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應在體內成像中尤其重要，因為溫度超過(guò)40oC會(huì )導致不可逆的損傷。因此，傳統的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實(shí)際應用于TPEF顯微鏡，峰值功率也會(huì )相應地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時(shí)縮短脈沖持續時(shí)間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質(zhì)上的時(shí)間間隔，同時(shí)提高了介質(zhì)被吸收的概率。

近日，西班牙FYLA公司利用先進(jìn)超連續譜全光纖激光器技術(shù)得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器，命名型號“SCH"。與傳統的100fs激光器相比，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過(guò)傳統飛秒激光器7倍的光子通量。

圖1：FCH 寬光譜光纖飛秒激光器，波長(cháng)范圍950-115nm，脈沖寬度15fs, 峰值功率>200kW

圖2：藍色線(xiàn)：SCH 飛秒激光器光譜曲線(xiàn)；橙色線(xiàn)：1um波段百秒激光器光譜曲線(xiàn)；灰色線(xiàn)：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜

但是，巨幅提高每個(gè)時(shí)間和面積上可用光子數量對圖像的真正影響是什么呢？

一、更高的激發(fā)效率，更高的圖像亮度

理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關(guān)，而激發(fā)效率*依賴(lài)于光子通量和熒光團的二階非線(xiàn)性激發(fā)截面(GM) 。作為一個(gè)例子，我們可以嘗試計算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬（如SCH飛秒激光器）和1050nm中波長(cháng)照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬（達200nm），可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比，這是一個(gè)更寬的光譜區域。

圖3：藍色曲線(xiàn)：以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率； 橙色曲線(xiàn)：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線(xiàn)：mRFP的二階非線(xiàn)性激勵截面(GM)

考慮到各波長(cháng)的峰值功率和激發(fā)截面，可以計算出mRFP的激發(fā)效率。結果表明，與傳統100fs激光器相比較，SCH飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。

圖4：藍色曲線(xiàn)：SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率； 橙色曲線(xiàn)：100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線(xiàn)：mRFP的二階非線(xiàn)性激勵截面(GM)

圖5：小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像，用SYTOX Green標記細胞核（黃色）和Alexa Fluor 568煥鈦標記肌動(dòng)蛋白絲（藍色）

二、多色同時(shí)激發(fā)

想象一下，同時(shí)成像多個(gè)波段范圍的熒光團，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長(cháng)的激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳統的100fs激發(fā)激光器，這通常是一個(gè)復雜的，有時(shí)甚至是不可能完成的任務(wù)。傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器（例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器）的光譜寬度通常在10~20nm范圍內，它們只能同時(shí)激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內的熒光團。因此，若想用單臺激光器去同時(shí)激發(fā)更多種類(lèi)的熒光團就需要帶寬更寬，脈沖更短的激光器。

SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時(shí)以1050nm為中心波長(cháng)提供200nm的帶寬，在這個(gè)帶寬范圍內 （橫跨900到1200nm）的所有綠色和紅色的熒光團都可以同時(shí)被這種激光器激發(fā)。這對于雙光子顯微鏡來(lái)說(shuō)，同時(shí)對多個(gè)熒光團成像成為一個(gè)可行的，實(shí)用的和簡(jiǎn)單的替代。

圖5：常見(jiàn)熒光探針激發(fā)波長(cháng)

圖6：小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像

用Sytox Green標記細胞核（洋紅色），FITC濾波器；用Alexa Fluor 568 Phaloidin標記肌動(dòng)蛋白絲（綠色），TRITC過(guò)濾器。兩種熒光標記物同時(shí)被SCH激光器激發(fā)，用尼康的熒光濾片組過(guò)濾熒光。

Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.

綜上所述，FYLA公司推出的新型、緊湊而強大的SCH全光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈沖持續時(shí)間和高峰值功率（>200kW），為體內樣本的低光損傷激發(fā)提供了強大的工具。結合全光纖激光器的緊湊性和堅固性性，SCH飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。

現在，FYLA公司推出SCH飛秒激光器的免費測試服務(wù)，包括運輸和安裝，無(wú)需承諾購買(mǎi)，此外對已購買(mǎi)的客戶(hù)提供全面免費2年質(zhì)保優(yōu)惠政策，如果您對SCH激光器感興趣并有意測試使用，請聯(lián)系上海昊量光電設備有限公司。

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