光學(xué)顯微鏡中生物細胞的溫度控制面

臨的挑戰和解決方案

眾 所 周 zhi溫度的變化對化學(xué)反應速率和生物機理都會(huì )產(chǎn)生影響，如何精準地控制“實(shí)驗溫度"以及研究不同溫度下的實(shí)驗樣本狀態(tài)尤為重要。因此，我們從成像樣品溫度控制面臨的常見(jiàn)問(wèn)題出發(fā)，致力于實(shí)現對顯微鏡視野中的溫度進(jìn)行高靈敏度的熱控制，由此獲得更嚴謹可靠且可重復的數據。

圖1：VAHEAT系列溫度控制器

一、顯微鏡中溫度控制問(wèn)題：

1.液體樣品蒸發(fā) - 介質(zhì)濃度變化，在較冷表面凝結；

2.溫度漂移；

3.溫度范圍有限（最大 45–55°C），標準控制系統中無(wú)法實(shí)現快速溫度變化；

4.在較高溫度下圖像質(zhì)量下降或 TIRF 角度損失；

5.某些設置的復雜性——多個(gè)反饋回路，需要特定的溫度校準；

6.不同的溫度和整個(gè)視場(chǎng)的溫度梯度 - 作為散熱片的浸泡物鏡。

圖 2：a) 使用 63x/1.4 NA 油浸物鏡時(shí)的散熱效果表征。平衡至 37°C 的大型環(huán)境室不足以將樣品保持在 37°C。當浸入式物鏡接觸樣品時(shí)，溫度至少降低 3°C，并且永遠不會(huì )回到 37°C，因為物鏡連接到顯微鏡主體，顯微鏡主體在室溫下位于腔室外部。VAHEAT 用于表征溫度下降并補償物鏡的冷卻效果。開(kāi)啟 VAHEAT 后，熱沉效應僅在qian 10 秒內出現，當溫度降至 36.2°C 時(shí)，儀器反饋回路會(huì )對其進(jìn)行校正。這樣，樣品始終精確地保持在 37°C。b) 旋轉圓盤(pán)共焦裝置光學(xué)成像中心 Erlangen，數據采集地。

二、顯微鏡溫度控制的常規解決方案

圖3 傳統生物溫度控制設備

傳統的溫度控制解決方案沒(méi)有一種設備可以wan 美地適合每個(gè)對溫度敏感的實(shí)驗，往往需要根據特定的應用為一個(gè)顯微鏡系統購買(mǎi)多個(gè)設備，然后有益地組合在一起。目前主要的解決方案有：

(1) 顯微鏡周?chē)拇笮铜h(huán)境箱。缺點(diǎn)是溫度測量距離樣品很遠，溫度變化可能非常緩慢。

顯微鏡需要幾個(gè)小時(shí)才能達到熱平衡，緩慢的平衡也意味著(zhù)與溫度相關(guān)的樣品漂移更顯著(zhù)。

(2) 平臺頂部孵化器/加熱平臺插入物與客觀(guān)加熱器相結合。當使用浸油物鏡時(shí)，這是一種有效但相當復雜且昂貴的解決方案。

(3) 基于 Peltier 元件的設備，具有wu 與 倫 比的溫度范圍，速度快且精確，但難以小型化，并且始終需要連接到元件上的散熱片，例如更大的金屬塊，這可能是不切實(shí)際的。

(4) 基于液體流動(dòng)的設備。用途廣泛且運行速度快，但不是很人性化。

(5) 另一種選擇是自己構建溫度控制器。主要適用于商業(yè)，因為其成本高且不具有普適性。

三、使用 VAHEAT 精確控制溫度

“VAHEAT"溫度控制系統操作簡(jiǎn)單，且不必擔心校準或降低圖像質(zhì)量的問(wèn)題，更重要的是可精確控制視場(chǎng)中的實(shí)際樣品溫度，并適用于單分子和超分辨率研究等高靈敏度顯微鏡應用設備。該裝置由四部分組成，分別是：(1)智能基底(2)顯微鏡適配器(3)探測頭(4)控制單元。核心部件是智能基底，這是一個(gè)可交換的部件，包含一個(gè)精確的四點(diǎn)溫度探頭和一個(gè)透明的薄膜加熱元件（如圖4所示）。使用 VAHEAT，溫度可以高達每秒 100°C 的速率變化，穩定誤差在遠低于 0.1°C 的設定值，且無(wú)需對顯微鏡進(jìn)行任何修改。VAHEAT 的核心是智能基板，功能化顯微鏡玻璃蓋玻片，其中靈敏的溫度探頭和透明加熱元件連接成一個(gè)有源反饋回路。Smart Substrates 每秒讀取和調節樣品溫度 83 次，確保它在不受環(huán)境條件影響的情況下精確地保持在設定值。Smart Substrates 還提供帶液體樣品容器的版本。該設備允許對類(lèi)似于 PCR 循環(huán)儀的任意溫度曲線(xiàn)進(jìn)行編程，并且與微流體兼容。雖然主要用于倒置配置中的高 NA 物鏡，除此之外，VAHEAT 系統的模塊化允許將其安裝在絕大多數光學(xué)顯微鏡上。

我們選擇了由氧化銦錫 (ITO) 制成的透明薄膜元件和直接內置在單個(gè)芯片中的溫度探頭的加熱策略，蓋玻片，樣品安裝在其上，見(jiàn)圖 3，這種基于 ITO 層的加熱解決方案最有利于熱均勻性。

圖 4：a) VAHEAT 組件。該設備由智能基板 (1) 智能基底 (2)顯微鏡適配器 (3) 探測頭 (4)控制單元。b) 智能基板是功能化蓋玻片，帶有透明的納米加熱元件和直接在視野中的溫度探頭。c) 當 VAHEAT 設置為 60°C 時(shí)，智能基板的熱圖像顯示整個(gè)區域均勻加熱。

圖 5：智能基板，VAHEAT 中使用的透明加熱元件（基底可定制）

由于 VAHEAT 僅加熱少量樣品，因此它可以在高溫下與高 NA 浸油物鏡一起使用。在一項實(shí)驗中，我們使用尼康 TIRF 100x/1.49 NA 物鏡在 75.0°C 下運行 VAHEAT 六小時(shí)，物鏡在前三個(gè)小時(shí)內由5°C 升溫至 29°C 并達到平衡，這表明 VAHEAT 可在更高的實(shí)驗溫度下使用。同時(shí)，VAHEAT 可以幫助所有生命科學(xué)家進(jìn)行溫度敏感實(shí)驗，對于某些領(lǐng)域，例如嗜熱微生物的實(shí)時(shí)成像、熱響應聚合物的表征或 DNA 納米技術(shù)，它是一項突破性技術(shù)，可以實(shí)現以前無(wú)法實(shí)現的實(shí)驗。自 2020 年推出以來(lái)，已開(kāi)始使用我們的設備的 50 個(gè)實(shí)驗室和公司在各個(gè)領(lǐng)域開(kāi)展工作，例如單分子生物物理學(xué)、膠體化學(xué)和細胞生物學(xué)。他們使用 VAHEAT 研究相變、液晶、脂質(zhì)層和囊泡以及人工細胞、ji 端微生物、熱休克反應或溶液中的 DNA 和蛋白質(zhì)。引用我們設備的第一批出版物現已發(fā)布。VAHEAT 被 Guillaume Baffou 教授（菲涅爾研究所）的實(shí)驗室用于嗜熱細菌的活細胞成像，以研究限制對細菌生長(cháng)的影響1。在 Wolfgang Zachariae 博士（生物化學(xué)領(lǐng)域的 MPI）的團隊中，在一個(gè)關(guān)于驅動(dòng)減數分裂的機制的研究項目中，VAHEAT 被用于通過(guò)共聚焦顯微鏡對酵母中的溫度敏感等位基因進(jìn)行熱休克和活細胞成像2。VAHEAT 還被用于在 Henrik Dietz 教授（慕尼黑工業(yè)大學(xué)）的實(shí)驗室中使用 DNA 折紙創(chuàng )建人工大分子傳輸的研究。該研究使用單分子 TIRF 成像進(jìn)行檢測3。

使用即插即用的 VAHEAT 系統，從實(shí)驗中導出溫度記錄也非常簡(jiǎn)單。因此，我們希望該設備不僅能夠實(shí)現新型實(shí)驗，而且有助于改進(jìn)成像實(shí)驗的報告和可重復性，從而為每個(gè)人提供高靈敏度顯微鏡。

關(guān)于Interherence：

德國Interherence公司擁有量子和生物光子學(xué)領(lǐng)域的專(zhuān)家團隊，為高靈敏度光學(xué)顯微鏡的發(fā)展做出很大貢獻。該團隊采用了現代納米制造和薄膜技術(shù)，推出了VAHEAT生物顯微溫度控制器，作為傳統顯微鏡的附加產(chǎn)品，shou次實(shí)現了在擴展溫度范圍內的精確溫度控制，以確保生物物理光學(xué)研究可靠的測量條件。

上海昊量光電作為德國Interherence公司在中國的代理商，可為您提供專(zhuān)業(yè)的技術(shù)服務(wù)，若您對Interherence公司提供的VAHEAT生物顯微溫度控制器有興趣，歡迎通過(guò)郵箱、電話(huà)或微信進(jìn)行溝通！

關(guān)于昊量光電：

昊量光電  您的光電超市！

上海昊量光電設備有限公司致力于引進(jìn)guo 外 先 進(jìn)性與創(chuàng )新性的光電技術(shù)與可靠產(chǎn)品！與來(lái)自美國、歐洲、日本等眾多zhi 名光電產(chǎn)品制造商建立了緊密的合作關(guān)系。代理品牌均處于相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展前沿，產(chǎn)品包括各類(lèi)激光器、光電調制器、光學(xué)測量設備、精密光學(xué)元件等，所涉足的領(lǐng)域涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫療、科學(xué)研究、國防及前沿的細分市場(chǎng)比如為量子光學(xué)、生物顯微、物聯(lián)傳感、精密加工、先進(jìn)激光制造等。

我們的技術(shù)支持團隊可以為國內前沿科研與工業(yè)領(lǐng)域提供完整的設備安裝，培訓，硬件開(kāi)發(fā)，軟件開(kāi)發(fā)，系統集成等優(yōu)質(zhì)服務(wù)，助力中國智造與中國創(chuàng )造! 為客戶(hù)提供適合的產(chǎn)品和提供完善的服務(wù)是我們始終秉承的理念！

參考文獻:

1. Molinaro, C., et al., Are bacteria claustrophobic? The problem of micrometric spatial confinement for the culturing of micro-organisms. RSC Advances, 11, 12500–12506 (2021).

2. Mengoli, V., et al., Deprotection of centromeric cohesin at meiosis II requires APC/C activity but not kinetochore tension. The EMBO Journal, 40, e106812 (2021).

3. St?mmer, P., A synthetic tubular molecular transport system. Nature Communications, 12, 4393, (2021).