純相位空間光調制器在PSF工程中的應用
一、引言
2014年諾貝爾化學(xué)獎揭曉，美國及德國三位科學(xué)家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎。獲獎理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”，從此人們對點(diǎn)擴散函數 (PSF) 工程的認識有了顯著(zhù)提高。
Moerner 展示了 PSF 工程與 Meadowlark Optics SLM 的使用案例，用于熒光發(fā)射器的超分辨率成像和 3D 定位。 PSF工程已被證明使顯微鏡能夠使用多種成像模式對樣本進(jìn)行成像，同時(shí)以非機械方式在模式之間變化。這允許對具有弱折射率的結構進(jìn)行成像，以及對相位結構進(jìn)行定量測量。 已證明的成像方式包括：螺旋相位成像、暗場(chǎng)成像、相位對比成像、微分干涉對比成像和擴展景深成像。
美國Meadowlark Optics 公司專(zhuān)注于模擬尋址純相位空間光調制器的設 計、開(kāi)發(fā)和制造，有40多年的歷史，該公司空間光調制器產(chǎn)品廣泛應用于自適應光學(xué)，散射或渾濁介質(zhì)中的成像，雙光子/三光子顯微成像，光遺傳學(xué)，全息光鑷(HOT)，脈沖整形，光學(xué)加密，量子計算，光通信，湍流模擬等領(lǐng)域。其高分辨率、高刷新率、高填充因子的特點(diǎn)適用于PSF工程應用中。
圖1. Meadowlark 2022年推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM
二、空間光調制器在PSF工程中的技術(shù)介紹
在單分子定位顯微鏡（SMLM）中，通過(guò)從相機視場(chǎng)中稀疏分布的發(fā)射點(diǎn)來(lái)估計單個(gè)分子的位置，從而克服了分辨率的衍射限制?？蓪?shí)現的分辨率受到定位精度和熒光標簽密度的限制，在實(shí)踐中可能是幾十納米的數量級。有科研團隊已經(jīng)將這種技術(shù)擴展到三維定位。通過(guò)在光路中加入一個(gè)圓柱形透鏡或使用雙平面或多焦點(diǎn)成像，可以估算出分子的軸向位置。光斑的拉長(cháng)（散光）或光斑大小的差異（雙平面成像）對軸向位置進(jìn)行編碼。將空間光調制器（SLM）與4F中繼系統結合到成像光路中，可以設計更廣泛的點(diǎn)擴散函數（PSF），為優(yōu)化顯微鏡的定位性能提供了可能。
利用空間光調制器（SLM）對熒光顯微鏡進(jìn)行校準，可以建立一個(gè)遠低于衍射極限的波前誤差，SIEMONS團隊就利用Meadowlark空間光調制器實(shí)現了高精度的波前控制。原理證明和實(shí)驗顯示，在1微米的軸向范圍內，在x、y和λ的精度低于10納米，在z的精度低于20納米。對這篇文獻感興趣的話(huà)可以聯(lián)系我們查閱文獻原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》
下面我們來(lái)具體看看是如何應用的，以及應用效果如何。
圖2. A）SLM校準分支和通過(guò)光路的偏振傳輸示意圖。額外的線(xiàn)性偏振濾波器沒(méi)有被畫(huà)出來(lái)，因為它們與偏振分光器對齊。B）相機上的強度響應作為λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數。C) 光學(xué)裝置的示意圖。一個(gè)帶有SLM的中繼系統被添加到顯微鏡的發(fā)射路徑中（紅色），一個(gè)單獨的SLM校準路徑（綠色）被納入發(fā)射中繼系統中。這允許在實(shí)驗之間進(jìn)行SLM校準。BE：擴束器，DM：分色鏡，L：鏡頭，LPF：線(xiàn)性偏振濾鏡，M：鏡子。OL：物鏡，PBS：偏振分光鏡，TL：管鏡。
光路如上圖2所示，包括一臺尼康Ti-E顯微鏡，帶有TIRF APO物鏡（NA = 1.49，M = 100），一個(gè)200毫米的管狀鏡頭，一個(gè)帶有SLM的中繼系統被建立在顯微鏡的一個(gè)出口端口。中繼系統包括兩個(gè)消色差透鏡，一個(gè)向列型液晶空間光調制器（LCOS）SLM（Meadowlark，XY系列，512x512像素，像素大小=15微米，設計波長(cháng)=532納米）和一個(gè)偏振分光器，用于過(guò)濾未被SLM調制的X偏振光。di一個(gè)消色差透鏡在SLM上轉發(fā)光束。
第二個(gè)中繼鏡頭確保在EMCCD上對熒光物體進(jìn)行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長(cháng)為405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。
這個(gè)配置增加了一個(gè)用于校準SLM的第二個(gè)光路。這個(gè)空降光調制器校準光路是為測量入射到SLM上的X和Y偏振光之間的延遲差而設計的，為了測量某個(gè)SLM像素的調制，需要將SLM映射到校準路徑的相機上。這種映射是通過(guò)在SLM上施加一個(gè)電壓增加的棋盤(pán)圖案來(lái)獲得的。平均捕獲的圖像和沒(méi)有施加電壓時(shí)的圖像之間的差異被用作角落檢測算法（來(lái)自Matlab - Mathworks的findcheckerboard）的輸入，以找到角落點(diǎn)。對這些點(diǎn)進(jìn)行仿生變換，并用于找到對應于每個(gè)SLM像素的CMOS像素。
圖3. SLM校準程序。A) 單個(gè)SLM像素的測量強度響應作為應用電壓的函數。每一個(gè)極值都對應于等于π的整數倍的相位變化，并擬合一個(gè)二階多項式以提高尋找極值的精度。強度被分割成四個(gè)部分，它們被縮放為[0 1]。這個(gè)歸一化的強度（B）被轉換為相位（C），并反轉以創(chuàng )建該特定電壓段和像素的LUT（D）。E）20個(gè)隨機選擇的SLM像素的歸一化強度響應，顯示像素間的變化。F) 測量的波前均方根誤差是校準后立即使用校準LUT的相位的函數，45分鐘后，以及制造商提供的LUT。G) 在不同的恒定相位下，用于成像光路的SLM部分的LUTs。暗點(diǎn)表示沒(méi)有3個(gè)蕞大值的像素。H) 測量的平均相位和預定相位之間的差異作為預定相位的函數。
圖3解釋了SLM像素的校準程序。首先，以256步測量作為應用電壓函數的強度響應，產(chǎn)生一連串的最小值和蕞大值，它們對應于π或2π的遲滯。在被照亮的SLM平面內的所有像素似乎有三個(gè)蕞大值，這意味著(zhù)總的相位調制為4π或1094納米。這些極值出現的電壓是通過(guò)對極值附近的三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合拋物線(xiàn)來(lái)找到的，這增加了精度，并充分利用了SLM的16位控制。然后，強度被分為四段，用公式（11）的逆值對這些段進(jìn)行縮放并轉換為相位。相位響應被用來(lái)為每個(gè)SLM像素構建一個(gè)單獨的查找表（LUT），以補償SLM的非均勻性。LUT參數在SLM上平滑變化，并與肉眼可見(jiàn)的法布里-珀羅條紋大致對應，表明相位響應的差異是由于液晶層厚度的變化造成的。額外的像素與像素之間的變化可能來(lái)自底層硅開(kāi)關(guān)電路的像素與像素之間的變化。完整的校準需要大約5分鐘（在四核3.3GHz i7處理器上的3分鐘掃描和2分鐘計算時(shí)間），但原則上可以?xún)?yōu)化到運行更快。
實(shí)驗結果：
圖4 測量的PSF與矢量PSF模型擬合之間的PSF比較。G-I）平均測量的PSF是由大約108個(gè)光子攜帶的信號通過(guò)上采樣（3×）和覆蓋所有獲得的斑點(diǎn)編制而成。比例尺表示1μm。
圖4顯示PSF模型的預測結果。通過(guò)這種方式，實(shí)驗的PSF是由∼108個(gè)光子的累積信號建立起來(lái)的。實(shí)驗和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的，甚至在蕞大的離焦值的邊緣結構也是非常匹配的。剩下的差異，主要是光斑的輕微變寬，是由于入射到相機上的光的非零光譜寬度，由于發(fā)射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區域的寬度。邊緣結構中也有一個(gè)小的不對稱(chēng)性，這可能是由光學(xué)系統中殘留的高階球差造成的。
所有工程PSF的一個(gè)共同特點(diǎn)是，與簡(jiǎn)單的二維聚焦斑點(diǎn)相比，它們的復雜性必須在PSF模型中得到體現，該模型被用于估計三維位置（可能還有發(fā)射顏色或分子方向）的參數擬合算法。簡(jiǎn)化的PSF模型，如高斯模型、基于標量衍射的Airy模型、Gibson-Lanni模型，或基于Hermite函數的有效模型都不能滿(mǎn)足這一要求。一個(gè)解決方案是使用實(shí)驗參考PSF，或用花樣擬合這樣的PSF作為模型PSF，或者使用一個(gè)或多個(gè)查找表（LUTs）來(lái)估計Z-位置。矢量PSF模型也可以用于復雜的3D和3D+λ工程PSF。矢量PSF模型是高NA熒光成像系統中圖像形成的物理正確模型。復雜的工程PSF的另一個(gè)共同特點(diǎn)是對擾亂設計的PSF形狀的像差的敏感性，并以這種方式對精度和準確性產(chǎn)生負面影響。為了實(shí)現jing確到Cramér-Rao下限（CRLB），即無(wú)偏估計器的蕞佳精度，光學(xué)系統的像差水平應該被控制在衍射極限（0.072λ均方根波前像差），這個(gè)條件在實(shí)踐中往往無(wú)法滿(mǎn)足。因此，需要使用可變形鏡或為產(chǎn)生工程PSF而存在的SLM對像差進(jìn)行校正。自適應光學(xué)元件的控制參數可以使用基于圖像的指標或通過(guò)測量待校正的像差來(lái)設置。后者可以通過(guò)基于引入相位多樣性的相位檢索算法來(lái)完成，通常采用通焦珠掃描的形式。這已經(jīng)在高數值孔徑顯微鏡系統、定位顯微鏡中實(shí)現，并用于提高STED激光聚焦的質(zhì)量。
三、PSF應用對液晶空間光調制器的要求
1.光利用率
對于這個(gè)應用來(lái)說(shuō)，SLM將光學(xué)損失降到蕞低是很重要的。PSF工程使用SLM來(lái)操縱顯微鏡發(fā)射路徑上的波前。在不增加損失的情況下，熒光成像中缺乏信號。使用具有高填充系數的SLM可以蕞大限度地減少衍射的損失。
Meadowlark公司能提供標速版95.6%的空間光調制器，分辨率達1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到*，一級衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿(mǎn)足創(chuàng )建復雜相位函數的同時(shí)，能夠提升系統的光利用率。
2.刷新率（蕞高可達1K Hz）
高速度可以實(shí)現實(shí)時(shí)的深層組織超分辨率成像?？梢?jiàn)光波段蕞高可達1K Hz刷新速度（@532nm）。
3.分辨率（1920x1200）
高分辨率的SLM是創(chuàng )建三維定位所需的復雜相位函數的理想選擇，如此能夠對每個(gè)小像元區域的光場(chǎng)進(jìn)行自由調控。
上海昊量光電作為Medowlark在中國大陸地區總代理商，為您提供專(zhuān)業(yè)的選型以及技術(shù)服務(wù)。對于Meadowlark SLM有興趣或者任何問(wèn)題，都歡迎通過(guò)電話(huà)、電子郵件或者微信與我們聯(lián)系。
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