在過(guò)去的 20 年里，遠場(chǎng)光學(xué)顯微鏡已經(jīng)跨越了以阿貝衍射極限為代表的一度難以逾越的分辨率障礙 ，開(kāi)發(fā)多種成功的方法，如受激發(fā)射損耗(STED) 、單分子定位方法(PALM 和 STORM) ，結構照明顯微術(shù)(SIM)和超分辨率光學(xué)波動(dòng)成像(SOFI)，這要歸功于圖像傳感器技術(shù)的改進(jìn)以及單分子光譜學(xué)的巨大進(jìn)步。

在這里，我們提出了一種新的顯微技術(shù)，它利用 SPAD23陣列探測器的超高時(shí)間分辨率來(lái)測量熒光波動(dòng)引起的相關(guān)性。在 ISM 架構中測量的這種相關(guān)性，然后被用作具有高達 4倍增強橫向分辨率和增強軸向分辨率的超分辨率圖像的對比度。僅用幾毫秒的像素駐留時(shí)間就可以獲得高信噪比的超分辨率圖像。

單光子探測器陣列SPAD23技術(shù)源于代爾夫特理工大學(xué)和洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院 7 年的研究工作和 6 項du特技術(shù)。它是由23個(gè)六角形封裝的單光子雪崩二極管組成的探測器陣列(SPADs)，具有更高的靈敏度和更低的噪聲。這款單光子探測器陣列SPAD23在其寬探測譜段內擁有>50%的探測效率，<100cps的暗計數水平，且因其du特的半導體工藝及設計實(shí)現了qian所wei有的填充因子＞80%。這款帶有時(shí)間標記功能（Time Tagging）的SPAD23整體尺寸只有xin用卡大小，是熒光顯微和量子信息領(lǐng)域的理想探測工具。

得益于SPAD23單光子陣列探測器的優(yōu)異性能，在與共聚焦顯微鏡搭配使用的過(guò)程中，增加了光的收集，最終獲得了更清晰、更明亮的圖像，其中還包含有關(guān)潛在分子功能、相互作用和環(huán)境的功能信息。

下圖提出了一種超分辨光學(xué)起伏圖像掃描顯微術(shù)的方案；設置在標準共焦顯微鏡的圖像平面中的針孔和單像素檢測器被替換為 23 像素的 SPAD 陣列，SPAD23單光子陣列探測器，增加了光線(xiàn)收集，提高了成像速度，減少了背景噪音，能夠在共聚焦顯微鏡中實(shí)現波動(dòng)對比度的超分辨率。

當掃描樣品臺時(shí)，每個(gè)光子的檢測時(shí)間記錄在相連的 FPGA 電路中，并以數字形式存儲。然后分析該數據，為陣列中的每個(gè)像素對產(chǎn)生第二個(gè)相關(guān)圖像，產(chǎn)生 232 個(gè)分辨率增強為 2 的相關(guān)圖像。如下圖b所示分辨率的提高可歸因于兩個(gè)因素。首先，如在 ISM 中一樣，每個(gè)小探測器的點(diǎn)擴展函數(PSF)是激發(fā)和其探測 PSF 的乘積。此外，從兩個(gè)這樣的 ISM PSFs 相乘得到的相關(guān)對比度實(shí)現了進(jìn)一步的變窄。在對圖像進(jìn)行適當的移動(dòng)以使其相互重疊之后，這一過(guò)程被稱(chēng)為像素重新分配，我們在空間頻率域中應用傅立葉重新加權濾波的最后階段。理論上，最終 SOFISM 圖像的 PSF 具有超過(guò)衍射極限 4 倍的橫向分辨率增強。

圖C 展示了 SOFISM，對相對稀疏的單個(gè) CdSe/CdS/ZnS核/殼/殼量子點(diǎn)(QDs)的樣品進(jìn)行成像。除了由于衍射造成的模糊之外，標準的共焦圖像(CLSM)包含大量的噪聲，這是由于量子點(diǎn)的發(fā)射強度在亮和暗狀態(tài)(閃爍)之間的波動(dòng)造成的。生成標準 ISM 圖像的分辨率提高了 2 倍，同時(shí)噪聲水平明顯降低，通過(guò)像素重新分配達到平均水平?；蛘?，通過(guò)計算熒光信號的二階相關(guān)矩陣，然后重復 ISM 過(guò)程的剩余部分(像素重新分配和傅立葉重新加權),產(chǎn)生分辨率提高 2.5 倍的更清晰的圖像。我們注意到，這個(gè)數字低于理論預測的數字，可能是由于探測器的有限尺寸、樣品振動(dòng)和其他技術(shù)方面的原因。

最后，還可以生成互相關(guān)階數高于 2 的 SOFISM 圖像；上圖C 展示了來(lái)自相同場(chǎng)景的 4 階相關(guān)圖像，產(chǎn)生橫向分辨率的 4倍增 強。 在類(lèi)似的實(shí)驗條件下，盡管檢測方案有些麻煩，SOFISM 已經(jīng)被證明在軸向分辨率上提供了 2 倍的改進(jìn)，雖然一些成熟的超分辨率技術(shù)已經(jīng)被生命科學(xué)研究團體采用并取得了巨大成功，但是 SPAD 陣列技術(shù)的最新進(jìn)展為可以針對特定需求提供超分辨率解決方案。SOFISM 可以提供一種實(shí)驗上簡(jiǎn)單的方法，在合理的曝光時(shí)間內提供顯著(zhù)的 3D 分辨率增強，并且沒(méi)有顯著(zhù)的實(shí)驗復雜性。

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