光束勻化在熒光成像平場(chǎng)照明中的應用

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡屬于光學(xué)顯微鏡家族，基于熒光的物理效應。利用了所謂的熒光染料的顏色特性，它們被特定波長(cháng)的光激發(fā)，并以不同的波長(cháng)再次反射吸收的光。

熒光顯微鏡的應用

熒光顯微鏡可以進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究、納米范圍內的測量值分析以及實(shí)時(shí)可見(jiàn)的大多數不同文化的過(guò)程。無(wú)論是在生物化學(xué)、生物物理學(xué)還是醫學(xué)領(lǐng)域：快速、詳細地檢測明亮、多彩的熒光有助于熒光顯微鏡的測量過(guò)程，并為新發(fā)現奠定基礎。zui 佳測量結果和zui 佳分辨率需要zui精確的光學(xué)器件——無(wú)論是通過(guò)光束路徑的優(yōu)化和聚焦、精確安裝的濾光片還是高質(zhì)量的鍍膜。

熒光顯微鏡的結構和功能原理

允許個(gè)別波長(cháng)通過(guò)的特殊濾光片可確保熒光顯微鏡下熒光的可視化。熒光顯微鏡的特殊濾光片包括：

勵磁濾光器

發(fā)射過(guò)濾器

二向色分束器

單獨的激發(fā)濾光片允許相應波長(cháng)的光通過(guò)，這是激發(fā)待檢樣品中特定染料所必需的。二向色鏡將刺激波長(cháng)反射到物鏡，物鏡將光束集中到標本上。從標本反 射的光集中在物鏡中，在其激發(fā)態(tài)通常具有比入射光更高的波長(cháng)。通過(guò)二向色鏡，反射光通過(guò)發(fā)射濾光片并降低到發(fā)射波長(cháng)。尚未在二向色鏡處停止的刺激光的殘留物在發(fā)射濾光片處被過(guò)濾掉。理想情況下，只有發(fā)射光撞擊顯微鏡內置的檢測器，并以相應的顏色可見(jiàn)。zui 佳測量結果需要均勻的照明，尤其是當需要幾微米或幾毫米的大視野時(shí)。在不均勻照明的情況下，例如，可能發(fā)生待檢查分子的不均勻激活。結果：中心的分子比入射照明光束外圍的分子發(fā)出更強烈的熒光。如果周邊沒(méi)有與中心等同地照亮，則當單獨記錄的圖像網(wǎng)格稍后合并時(shí)，陰影繼續出現。因此，細胞和組織樣本等測量不能用于可靠的分析。這些問(wèn)題可以通過(guò)使用 a|TopShape a|BeamExpander 來(lái)解決。通過(guò)使用非球面可以實(shí)現這些元素在系統中。我們的系統以其緊湊的設計、精度和zui高的光學(xué)質(zhì)量而令人信服。使用光學(xué)組件a|TopShape 和 a|BeamExpander 可以將高斯光束轉換為均勻的平頂輪廓，從而在整個(gè)視野中實(shí)現均勻照明。所產(chǎn)生的平場(chǎng)照明具有高空間相干性、wu與倫bi的光學(xué)性能和 > 95% 的高均勻性。分子的均勻激發(fā)和zui小的圖像重疊 (5%) 可以保證讓您wan全滿(mǎn)意。

下圖顯示了熒光顯微鏡的工作原理和一般結構。

熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡應用

基于激光的熒光顯微鏡內的定量分析可能會(huì )因高斯光束輪廓產(chǎn)生的不均勻 照明而變得復雜。光源和照明光學(xué)等因素會(huì )影響均勻性。當要檢查大視野 (FOV)時(shí)，這些功能尤其具有挑戰性。測量圖像由圖像網(wǎng)格在熒光顯微鏡中生成。以邊緣重疊的方式獲取單個(gè)圖像，并且可以在后處理中組合它們。如果照明不均勻，zui終圖像的每個(gè)單獨圖像周?chē)紩?huì )有變暗的邊緣 - 細胞和組織樣本的測量變得不可靠。光照不均勻的另一個(gè)缺點(diǎn)：分子激活不均勻。那些靠近光束中心的熒光比邊緣的熒光更多。位于奧蘭多的中佛羅里達大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)院的一個(gè)研究團隊通過(guò)將aphericon 的光束整形器 a|TopShape 和 a|BeamExpander 集成到顯微鏡裝置中，從而克服了這些問(wèn)題。平場(chǎng)照明 (FFI) 設置將高斯光束塑造成統一的平頂輪廓。a|TopShape 對入射激光束大小的變化具有ji高的容忍度 (± 10 %)，并且以消色差方式運行。非常好的光學(xué)性能（均勻性 > 95%）可實(shí)現均勻照明，從而激活分子。此外，FFI 設置可實(shí)現無(wú)邊界拼接成像，圖像重疊zui小 (5%)。

定量熒光成像的平場(chǎng)照明

項目介紹：

高斯輪廓的不均勻光照使得基于激光的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡的定量分析具有很高的挑戰性。許多因素，包括光源和照明光學(xué)有助于均勻性。當需要幾百微米或毫米尺度的大視場(chǎng)時(shí)，這些特性尤其困難。獲得一個(gè)圖像網(wǎng)格，使邊界重疊，并在后處理中將圖像拼接在一起。如果光照不均勻，zui終拼接的圖像在每個(gè)單獨的圖像周?chē)加邪档倪吔?。因此，細胞和組織樣本的測量是不可靠的。非均勻光照的另一個(gè)缺點(diǎn)是分子的不均勻激活。那些zui靠近光束中心的人比那些靠近邊緣的人熒光更強烈。

項目實(shí)施：

來(lái)自美國佛羅里達州奧蘭多市中佛羅里達大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)學(xué)院的一個(gè)研究團隊，在他們的顯微鏡設置中使用非球面 TopShape 和 BeamExpander 時(shí)，可以克服這些問(wèn)題(b)，這兩個(gè)都是由非球面組成的非常緊湊和高精度的折光光學(xué)組件。因此，他們能夠呈現平場(chǎng)照明(FFI)，其中高斯光束被塑造成一個(gè)均勻的平頂輪廓(a)。光束整形裝置非常容忍入射激光束的大小變化，接受±10%，同時(shí)也是消色差的(e)。FFI 的工作距離(f)長(cháng)，空間相干性高，可以在多色單分子成像中實(shí)現均勻的 epi1 和 TIRF2 照明。所使用的光學(xué)器件具有吳與倫bi的光學(xué)性能，均勻性> 95%，允許均勻的照明(c & d)，從而均勻地激活分子。此外，FFI 實(shí)現了zui小圖像重疊(5%)的無(wú)界縫合成像。

說(shuō)明: 1,外延照明模式是指從樣品的一側進(jìn)行照明和檢測;

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