傅里葉光場(chǎng)顯微成像技術(shù)—2D顯微鏡實(shí)現3D成像

摘要：近年來(lái)，光場(chǎng)顯微技術(shù)的應用越來(lái)越廣泛，針對光場(chǎng)顯微鏡的改進(jìn)和優(yōu)化也不斷出現。目前市場(chǎng)的2D顯微鏡比比皆是，如何在其基礎上實(shí)現三維成像一直是成像領(lǐng)域的熱門(mén)話(huà)題，本次主要討論3D成像數字成像相機的研究，即3D光場(chǎng)顯微鏡成像技術(shù)，隨著(zhù)國內外學(xué)者通過(guò)研究提出了各種光場(chǎng)顯微鏡的改進(jìn)模型，將分辨率、放大倍數等重要參量進(jìn)行了顯著(zhù)優(yōu)化，大大擴展了光場(chǎng)顯微技術(shù)的應用領(lǐng)域。同時(shí)，由于近年來(lái)微型化集成技術(shù)的發(fā)展，微型化光場(chǎng)顯微技術(shù)也逐漸成為國內外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

1. 傅里葉光場(chǎng)顯微成像技術(shù)在國內外的發(fā)展

2014年，Rober等人在核熒光顯微鏡的像平面上放置了一個(gè)微透鏡陣列，構建了一個(gè)光場(chǎng)反卷積顯微鏡(LFDM)裝置，如圖1所示。為了克服LFM中軸向和橫向空間分辨率之間的權衡，研究團隊通過(guò)利用記錄數據的混疊并使用適用于LFM的3D反卷積算法，有效地獲得了改進(jìn)的橫向和軸向分辨率，蕞終在生物樣品內部的橫向和軸向維度上，分別實(shí)現了高達約1.4μm和2.6μm的有效分辨率。

圖1

2019年，我國的學(xué)者團隊通過(guò)改變微透鏡陣列與透鏡和圖像傳感器之間的相對位置，使微透鏡陣列遠離了光學(xué)系統的本征像面，第1次提出了高分辨率光場(chǎng)顯微鏡（HR-LFM）概念，有效避免了傳統光場(chǎng)顯微鏡產(chǎn)生的重建偽影。同時(shí)由于微透鏡陣列的移動(dòng)，圖像傳感器不再記錄原始像平面處的圖像混疊，大大提高了成像分辨率，如圖2所示。

圖2

這一裝置廣泛應用于活體細胞成像，三維分辨率為300nm-700nm，成像深度為幾微米，體積采集時(shí)間為毫秒級。該方法可以將線(xiàn)性調頻作為一種特別有用的工具，在多個(gè)時(shí)空水平上理解生物系統。此后隨著(zhù)光場(chǎng)顯微技術(shù)的快速發(fā)展，光場(chǎng)顯微鏡產(chǎn)生了更多類(lèi)型的演變，如圖1-7所示。研究人員通過(guò)在微型顯微鏡平臺上引入光場(chǎng)顯微鏡（LFM），構建了微型化光場(chǎng)顯微鏡（MiniLFM），證明了單次掃描體積重建，如圖3所示。這是通過(guò)將微透鏡陣列（MLA）與光場(chǎng)反褶積算法相結合，將微透鏡陣列（MLA）引入到現有的微型鏡平臺上。然而，這種設計在多個(gè)深度上存在橫向分辨率不均勻的問(wèn)題。

圖3

2. 微型化集成技術(shù)的發(fā)展

光學(xué)顯微鏡是一種在很大程度上抵制集成的技術(shù)，它通常仍然是一種體積龐大、價(jià)格昂貴的桌面儀器。在神經(jīng)科學(xué)中，顯微技術(shù)在活體動(dòng)物身上得到了廣泛的應用，但是傳統顯微鏡的局限性阻礙了腦成像實(shí)驗的范圍和規模。2011年，KunalKGhosh等人第1次提出了光場(chǎng)熒光顯微鏡的微型化集成，如圖4所示。

這是一種微型集成熒光顯微鏡，由大量可生產(chǎn)部件制成，包括半導體光源和傳感器。該設備能夠在活躍的老鼠身上進(jìn)行0.5mm3的高速細胞成像。與高分辨率光纖顯微鏡相比，這一設備在光學(xué)靈敏度、視野、分辨率、成本和便攜性方面具有優(yōu)勢。

圖4

傳統的光場(chǎng)顯微鏡（LFM）同時(shí)捕獲入射光的二維空間和二維角度信息，能夠通過(guò)單個(gè)相機計算重建樣本的完整三維體積信息，如圖5所示。對于傳統的線(xiàn)性調頻，將微透鏡陣列（MLA）放置在寬視場(chǎng)顯微鏡的本征像面（NIP）上，并且光學(xué)信號以混疊方式記錄在MLA后焦平面的微透鏡上，但線(xiàn)性調頻的空間信息采樣模式是不均勻的，導致了重建偽影的出現。除此之外，體積重建采用波光學(xué)模型的PSF反褶積。傳統線(xiàn)性調頻的PSF在橫向和軸向尺寸上都是空間變化的，這增加了計算成本，使得重建相當慢，不利于快速觀(guān)察動(dòng)態(tài)或功能數據。

圖5

傅里葉光場(chǎng)顯微鏡通過(guò)在透鏡和微透鏡陣列之間插入一個(gè)新的光學(xué)透鏡，第1次將光學(xué)變換從時(shí)域轉入傅里葉域（FD），如圖6所示。在傅里葉頻域光學(xué)系統中，所有信號都可以看做不同正弦函數的疊加，因此這一光學(xué)透鏡的引入可以將入射光波變成不同頻率的單色平面波的線(xiàn)性組合，由于不同單色平面光具有不同的系數，即復振幅，因此后焦面上不同坐標的光強分布，對應入射光波分解成的不同頻率單色光波的功率，即位置坐標和光的頻率是一一對應的。來(lái)自中繼像面處圖像的光場(chǎng)被傅里葉透鏡轉換為傅里葉頻域下的光場(chǎng)，并與物鏡后瞳孔波前共軛，微透鏡陣列通過(guò)對波前分段，在單個(gè)透鏡后傳輸角度信息，從而使相機在不同區域輸出圖像。

圖6

傅里葉光場(chǎng)系統通過(guò)在傅里葉域（FD）中記錄4D光場(chǎng)，成像方案主要通過(guò)兩種方式對LFM進(jìn)行變換。首先，FD系統允許以一致的混疊方式分配入射光的空間和角度信息，有效地避免由于冗余而產(chǎn)生的任何偽影。第二，由于FD以并行方式處理信號，因此可以用統一的三維點(diǎn)擴展函數來(lái)描述圖像形成，從而大大減少了計算成本。

3. 光場(chǎng)傳播和成像模型

結合光場(chǎng)顯微技術(shù)和傅里葉變換理論的有關(guān)知識，微型化傅里葉光場(chǎng)顯微鏡的設計是在光場(chǎng)顯微鏡的基礎上引入一個(gè)新的光學(xué)透鏡，這一透鏡放置的位置應遠離像平面NIP處，同時(shí)應放置在主透鏡和微透鏡陣列之前；根據微型化的實(shí)際需要，本次選用的物鏡系統是折射率呈梯度變化的自聚焦透鏡GRINlens。由此可以初步得出微型化傅里葉光學(xué)系統的主要光學(xué)結構如圖7所示，這也是光場(chǎng)傳播和成像的主要路徑。

圖7

4. 光路設計

傅里葉光場(chǎng)顯微鏡是在改進(jìn)后的高分辨率光場(chǎng)顯微鏡的基礎上，在透鏡和微透鏡陣列之間插入一個(gè)新的透鏡，該透鏡能將光場(chǎng)從時(shí)域轉換成頻域，起到傅里葉變換的作用。為了實(shí)現微型化，物鏡系統采用GRINlens實(shí)現，具體的光路原理圖如圖8所示。

圖8

5. 機械系統整體結構設計

本設計的光學(xué)外殼是基于傅里葉光場(chǎng)顯微鏡的微型化而產(chǎn)生的。隨著(zhù)微型化集成技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者團隊開(kāi)始研究將光場(chǎng)顯微技術(shù)與微型化技術(shù)進(jìn)行結合，也由此設計出了適用于不同光路的微型化結構模型。如圖9所示，一學(xué)者團隊利用GRINLENS作為物鏡系統，設計完成了一般光學(xué)顯微鏡和光場(chǎng)顯微鏡的微型化結構。通過(guò)調整各元器件的相對位置，盡可能壓縮整個(gè)微型化外殼的尺寸，在微型化的同時(shí)實(shí)現光路設計的預期功能。

圖9

基于這一研究成果，根據所設計的微型化傅里葉光場(chǎng)顯微鏡，在原有光場(chǎng)顯微鏡微型化外殼的基礎上，加入一個(gè)新的凹槽，用來(lái)安放新加入的傅里葉透鏡。結合前文設計好的各元器件的尺寸參數和相對位置，結合光路預期實(shí)現的功能，蕞終設計并完成了微型化傅里葉系統的光學(xué)外殼結構，具體尺寸及結構如圖10所示。

圖10

圖11

6. 總結

15年來(lái)，人們一直提出實(shí)施光場(chǎng)顯微鏡（也稱(chēng)為全透視或整體顯微鏡）。光場(chǎng)顯微鏡能夠記錄厚樣品的3D信息，而無(wú)需執行多次拍攝。通過(guò)捕獲不同的視角并使用適當的算法，可以進(jìn)行深度重建（關(guān)注不同的平面）并計算樣品寬度和長(cháng)度上可區分部分的深度圖。隨著(zhù)該技術(shù)進(jìn)一步的拓展，應用已逐漸走向大眾并實(shí)現產(chǎn)品化，比如上海昊量光電代理的西班牙的DOIT 3D Micro相機如圖11所示，DOIT®（數字光學(xué)成像技術(shù)）基于全能信息捕獲的范式轉變。它設計不是在圖像平面附近捕獲信息（傳統技術(shù)可以這樣做），而是在傅里葉平面中捕獲信息。通過(guò)這種方式，可以直接獲得正交透視，而無(wú)需任何數字處理。此外，還避免了使用小微透鏡的要求，這避免了限制傳統全透鏡模式分辨率的波粒二象性，通過(guò)zui簡(jiǎn)單的方法讓2D顯微鏡實(shí)現3D成像如圖12所示。

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