用單個(gè)錐形光纖植入物進(jìn)行深度分辨光纖光度測定

（轉譯自文獻Depth-resolved fiber photometry with a single  tapered optical fiber implant）

活體熒光檢測可用于記錄和研究自由運動(dòng)動(dòng)物腦深部遺傳定義的神經(jīng)群的功能信號。例如，纖維光度法通過(guò)監測特定細胞類(lèi)型神經(jīng)活動(dòng)時(shí)熒光隨時(shí)間變化來(lái)實(shí)現。這些方法推動(dòng)了基于光子學(xué)和光電子平臺技術(shù)以及使用多路復用技術(shù)記錄多個(gè)亞種群活動(dòng)方法的發(fā)展。通常情況下，光纖測量方案依賴(lài)于扁平切割光纖進(jìn)行刺激和收集熒光2-9,11 - 19。

然而，由于組織散射和吸收效應，扁平切割光纖的可訪(fǎng)問(wèn)記錄深度僅限于光纖jian 端附近，這與探針的幾何形狀相結合，決定了熒光激發(fā)和收集效率20,21。簡(jiǎn)單的幾何計算表明，扁平切割光纖收集的信號量隨著(zhù)與光纖面距離的增加而急劇減少。此外，重新配置收集幾何形狀以達到多個(gè)區域是不可能的，因為改變光收集場(chǎng)需要重新定位光纖。此外，扁平切割光纖的幾何形狀嚴重損害組織，在大腦中，甚至在植入后很長(cháng)一段時(shí)間內，也會(huì )誘導裝置周?chē)纳窠?jīng)膠質(zhì)激活22,23。盡管如此，平劈光纖被廣泛用于評估腦深部區的神經(jīng)活動(dòng)3,11-19。

在這里，我們提出了一種克服這些限制的方法:我們利用TF中光傳播的模態(tài)特性在錐度的大光學(xué)活性區域上構造光收集模式并進(jìn)入更深的細胞。除了比扁平切割光纖22具有更小的侵入性外，TF探針還具有du 特的光收集特征，包括:(i)沿光纖軸在高達2mm的組織上具有均勻的界面，(ii)通過(guò)分時(shí)多路復用沿錐度進(jìn)行多點(diǎn)收集的能力，以及(iii)通過(guò)微結構光纖錐度的非平面表面來(lái)設計任意收集體積的能力。

下面，我們量化了錐形光纖的三維(3D)光采集區域，發(fā)現錐形光纖在大區域(如小鼠的大腦皮質(zhì)和紋狀體)均勻地收集熒光。當與大面積光傳輸相結合時(shí)22,24，這導致在有源光學(xué)表面相似的照明功率密度下，錐形光纖比扁平切割光纖的信號采集更高。這是因為大面積的錐形光纖可以提供更多的總照明功率，即更多的光子，同時(shí)將電池暴露在中等的功率密度下。我們的研究表明，通過(guò)利用選擇性光傳遞和收集，轉錄因子能夠在自由運動(dòng)的動(dòng)物中對功能性熒光信號進(jìn)行多點(diǎn)探測，包括沿著(zhù)纖維錐度動(dòng)態(tài)記錄來(lái)自多個(gè)腦區的信號。我們通過(guò)在自由運動(dòng)的小鼠中使用單個(gè)錐形光纖完成獎勵收集任務(wù)，快速掃描興奮光并同時(shí)監測背側和腹側紋狀體的多巴胺瞬變，證明了這種實(shí)驗的可行性。

zui后，我們將控制光沿錐度傳播的模態(tài)效應與金屬涂層錐形光纖表面的微觀(guān)和納米結構相結合，從而設計了收集體積25,26。我們將收集體積限制在錐度表面的一個(gè)角部分，這樣，光學(xué)窗口位于沿著(zhù)錐形光纖界面的特定深度，只有很少的細胞體。這種方法與光學(xué)窗口的選擇性光傳輸相結合，提供了具有高度空間選擇性的深度細胞體積的雙向接口。

結果

錐形光纖的光收集特性

圖1 |錐形光纖的光收集。a，腦組織中扁平切割光纖（FF）和錐形光纖(TF)的光采集示意圖。實(shí)驗收集概況旁邊的纖維。b，對錐形光纖的光采集場(chǎng)成像的光學(xué)設置。在pbs -熒光素滴中，一個(gè)圍繞錐形光纖的雙光子激發(fā)點(diǎn)被掃描。產(chǎn)生的熒光可通過(guò)未脫膜的PMT(顯微鏡PMT)和補片光纖遠端的光纖PMT檢測。Ls，透鏡系統；F1和F2，帶通熒光濾波器；L2,鏡頭。c，在PBS-熒光素溶液中，隨著(zhù)NAs的增加錐形光纖的典型ξT(x,y)集合字段(每個(gè)字段歸一化到其zui大值);比例尺，500µm。d，比較在pbs -熒光素溶液中掃描的雙光子熒光光斑采集的光子數(像素停留時(shí)間，3.2µs)，內嵌扁平切割光纖與NA = 0.66， ψ = ~4°的錐形光纖；FF圖中的等值線(xiàn)顯示錐形光纖收集到的zui大光子數。比例尺，500µm。e, NA-0.66 錐形光纖在pbs -熒光素溶液中的光子收集的等距線(xiàn)(頂部色條，每個(gè)像素的光子數;停留時(shí)間，3.2µs)；等值線(xiàn)在10、20、50和100光子處繪制。比例尺，500µm。f，上，遠場(chǎng)成像系統示意圖。L1、L2、L3，成像鏡；BPF，帶通濾波器;NBF，近紅外阻斷濾波器；sCOMS，科學(xué)互補金屬氧化物半導體。底部，纖維輸出小關(guān)節的遠場(chǎng)圖像顯示，當光源沿著(zhù)錐形光纖移動(dòng)時(shí)，直徑增加的環(huán)。比例尺，0.3 2π/λ。g, 錐形光纖在距離錐尖d處采集的點(diǎn)狀光源熒光的橫向矢量分量kt。a-d的實(shí)驗重復了至少10次，得到了相似的結果。

我們在準透明的熒光溶液中表征了錐形光纖的光聚集特性(圖1)。我們在浸泡錐形的pbs熒光素(30µM)液滴中實(shí)現了一個(gè)雙光子掃描系統，以產(chǎn)生局限的熒光斑，就像各向同性的點(diǎn)狀源一樣(圖1b)。光柵掃描錐度周?chē)獍邥r(shí)產(chǎn)生的熒光由與掃描頭同步的兩個(gè)光電倍增管(PMT)收集:(i)顯微鏡PMT，放置在標準的非脫封，外熒光路徑，和(ii)光纖PMT，置于連接的光纖貼片的遠端至錐形光纖20、21(圖1b)。用顯微鏡PMT得到的參考圖像對視場(chǎng)中雙光子激發(fā)效率的輕微不均勻性進(jìn)行校正后，來(lái)自光纖PMT的信號報告了錐形光纖的熒光光采集場(chǎng)，定義為ξT(x,y)。測量了不同數值孔徑(NAs)和芯徑，但錐度角(ψ)近似為~4°的光纖的集合場(chǎng)ξT(x,y)(圖1c)。我們發(fā)現沿錐度的光敏區域，即收集長(cháng)度L，隨著(zhù)光纖NA的增大和ψ的減小而增大(補充圖1a)。因此，錐形光纖的采集長(cháng)度是可以定制的通過(guò)修改光纖NA和錐度角ψ，從幾百微米提高到約2 mm。這一發(fā)現揭示了錐形光纖和扁平切割光纖的收集特性的重要差異，因為對于扁平切割，收集深度基本上不依賴(lài)于NA21。

我們比較了錐形光纖和扁平切割的采集字段，NA分別為0.66(圖1d)和0.39(補充圖1b)。錐形光纖的光學(xué)主動(dòng)表面沿波導軸線(xiàn)延伸，導致沿錐度方向相對均勻的收集。從集合字段ξF(x,y)中可以看出，扁平切割光纖在端面附近采集到較高的信號強度。相反，錐形光纖的收集效率曲線(xiàn)在錐度面附近達到一個(gè)較低的zui大值，并遵循在jian 端增寬的兩葉形狀(圖1e和補充圖1c、d和2)如圖ξ(x,y,z)區域所示(補充圖1d)，被采集信號圍繞錐度軸對稱(chēng)。

這是因為錐形光纖表面通過(guò)增加波導直徑27的橫向傳播分量kt的模態(tài)子集與周?chē)h(huán)境進(jìn)行光學(xué)界面。因此，由光纖的直部分所支持的全部傳播模式逐漸沿錐形填充，導致錐形光纖軸的均勻收集。相反，扁平切割光纖的所有傳播模式都在纖維面耦合。

為了更好地表征錐度采集光的物理特性，我們從靠近錐度表面的點(diǎn)樣點(diǎn)對熒光進(jìn)行雙光子激發(fā)時(shí)，對所采集光的遠場(chǎng)進(jìn)行成像(圖1f)。我們發(fā)現不同的模態(tài)子集在特定的錐度直徑下被填充(圖1f,g)，因為相機上的圖像是一個(gè)環(huán)，它的半徑隨著(zhù)熒光源和錐度jian 端之間的距離的函數而增加。環(huán)半徑h是直接測量與進(jìn)入纖維的導模相關(guān)的波矢量的橫向分量kt 27,28。因此，光線(xiàn)從錐體的不同截面進(jìn)入，受到不同的引導模式子集的引導，在相機上產(chǎn)生不同直徑的環(huán)，從而建立了h與熒光信號沿錐體的位置之間的相關(guān)性。

圖2 |可重構的錐形光纖光收集。a，與熒光素均勻染色腦片皮質(zhì)接觸的0.66 NA 扁平切割光纖的光采集場(chǎng)ξ(x,y)(左)和光度效率場(chǎng)ρ(x,y)(右)。b，與a一樣，將0.66-NA 錐形光纖插入經(jīng)熒光素均勻染色的腦切片中。c，使用全NA照明和藍色激光刺激并收集大大腦區域熒光的系統示意圖。收集的光在貼片光纖中反向傳播，并通過(guò)一個(gè)二色鏡將其導向PMT與藍光區分開(kāi)來(lái)。L1和L2，晶狀體；BPF，帶通濾波器；Fluo，熒光信號；Exc，激發(fā)光。d，定點(diǎn)照明將采樣體積限制在錐形光纖的子區域。左，集光域ξT(x,y)；中心，在光纖jian 端選擇性照明得到的光度效率場(chǎng)ρT(x,y)；右，ρT(x,y)視場(chǎng)是在較寬錐度直徑下選擇性照明獲得的。e，提出的多站點(diǎn)光度測量系統的原理圖，該系統使用時(shí)分復用配置的PMT探測器。藍色激光束以增加的輸入角(θ1， θ2)射入光纖貼片線(xiàn)。低角度注入時(shí)，激光在錐尖處耦合，產(chǎn)生熒光信號F1；相反，當在θ2處注入時(shí)，激光在較大錐度直徑下耦合，產(chǎn)生熒光信號F2。熒光由PMT檢測，其輸出信號與光注入刺激同步。該熒光信號根據其時(shí)間戳歸屬于相應的區域。a、b、d實(shí)驗重復三次，結果相似。

在大而深的區域統一收集

為了證明在存在散射和吸收的情況下，錐形光纖可以在大的和深部腦區獲得均勻的采集，我們測量了均勻熒光染色的腦片上扁平切割光纖和錐形光纖的熒光采集場(chǎng)ξ(x,y)和熒光激發(fā)場(chǎng)β(x,y)。結合這些場(chǎng)得到了光度測量效率場(chǎng)ρ(x,y)，它描述了熒光信號對激發(fā)光強度的依賴(lài)性20,21，從而給出了采樣組織體積的詳盡幾何信息。我們比較了匹配N(xiāo)A和內核大小的扁平切割光纖和錐形光纖的采集和光度視野。如圖2a所示，插入到皮層表面的扁平切割光纖域ξF(x,y)和域ρF(x,y)，扁平切割光纖有效地與皮層的淺層連接;然而，他們只提取了距離透鏡面300 μm以外的信息。相反，錐形光纖的界面更均勻，錐體的光學(xué)活性區域周?chē)心X組織(圖2b)。利用ξ(x,y)的對稱(chēng)性，我們計算了由波導采樣的體積作為采集信號的函數(補充圖3)，并確定了產(chǎn)生給定比例的總采集信號的組織體積。我們發(fā)現錐形光纖的體積比扁平切割光纖大(補充圖4)。這一特性可以在使用全錐度表面來(lái)激發(fā)和收集信號的實(shí)驗中加以利用(圖2c)。

沿錐度可重新配置多站點(diǎn)收集

使用位點(diǎn)選擇性光傳輸和模分解復用策略，錐形光纖的收集量可以沿著(zhù)錐度在多個(gè)位置之間動(dòng)態(tài)切換22,27,28。為了定義可尋址的體積幾何配置，我們獲得了一個(gè)插入到熒光素染色腦片上的0.66-NA 錐形光纖的ξT(x,y)集合域(圖2d)。使用基于振鏡的快速掃描系統(圖2e)，我們通過(guò)增加kt激發(fā)模態(tài)子集將激光注入錐形光纖，從而將照明體積限制在可通過(guò)改變光輸入角度22、27、28沿錐度部分逐漸移動(dòng)的有限區域(補充圖5a、b)。由于熒光只在有限的被照射組織中產(chǎn)生(補充圖5a、b)，錐形光纖可以動(dòng)態(tài)地檢查一個(gè)功能區的多個(gè)位點(diǎn)。作為原理證明，我們結合ξT(x,y)和β(x,y)，測量了由選址照明產(chǎn)生的光度測量效率場(chǎng)ρT(x,y)。ρT(x,y)在可從光線(xiàn)注入角度推斷的有限區域內zui大(圖2d)。利用這一特性，熒光信號可以歸因于使用時(shí)分復用被照亮的大腦區域(圖2e)。這是通過(guò)增加輸入角(θ1， θ2)將激光發(fā)射到光纖補片線(xiàn)來(lái)激發(fā)沿錐度在限制位置耦合的不同模態(tài)子集來(lái)實(shí)現的。每個(gè)照明位置產(chǎn)生的熒光(分別為F1、F2)由錐度采集，在光纖補片線(xiàn)中反向傳播，由二色鏡識別，zui后由PMT檢測，PMT輸出信號與光注入刺激同步(圖2e)。

為了證明這種方法對可能由動(dòng)物運動(dòng)引起的模態(tài)混合有彈性22，我們在pbs -熒光素浴中進(jìn)行深度分辨光度測量時(shí)，在手動(dòng)搖動(dòng)光纖貼片的同時(shí)監測了遠場(chǎng)模式。記錄到的強度波動(dòng)<1%，遠場(chǎng)環(huán)直徑和厚度變化<0.8%(對于未受擾動(dòng)的纖維;補充圖5c、d和補充視頻1、2)。

圖3 |基因染色的神經(jīng)群增強的光度測定。a，皮質(zhì)表面0.39-NA 扁平切割光纖的光采集;從左到右:雙光子表觀(guān)熒光(2p-epi)圖像，ξ(x,y)場(chǎng)，ρ(x,y)場(chǎng)，軸上采集輪廓ρ(x,y)。b, a為NA = 0.39 扁平切割光纖，接近L5。c, a,b表示一個(gè)在大腦皮層插入的0.39 NA的錐形光纖。比例尺(a?c)， 250µm。d，三種實(shí)驗配置的光度測量系統示意圖:一個(gè)錐形光纖插入整個(gè)皮質(zhì)，一個(gè)扁平切割光纖插入L2/3，一個(gè)扁平切割光纖插入至L5。e, Thy1-ChR2-EYFP小鼠腦片的熒光信號強度(n = 10)，在大腦皮層插入0.39 NA 錐形光纖(ψ = 4°)(藍色)，在L2/3插入0.39- NA 扁平切割光纖(橙色)，在L5插入0.39- NA 扁平切割光纖(紫色)來(lái)刺激和檢測熒光。調整激光功率以獲得相似的光活性區域的功率密度(0.1 mW mm-2)。陰影區域表示平均值上的標準誤差?；揖€(xiàn)連接在同一實(shí)驗中從同一腦片獲得的數據。采用雙側Student t檢驗進(jìn)行統計學(xué)分析，顯著(zhù)性α = 0.001。f, 錐形光纖插入固定腦片紋狀體的亮視野圖像(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。g, f. h中錐形光纖的光采集域ξT(x,y)，將ξT(x,y)域與位點(diǎn)選擇性傳遞光相結合，產(chǎn)生可重構的紋狀體子區域多位點(diǎn)光采集效率域ρT(x,y)。比例尺(f?h)， 250µm。在a-c、g、h重復實(shí)驗3次，結果相似。

增強熒光法在基因染色的神經(jīng)群體

對于錐形光纖，我們使用了0.39-NA 錐形光纖 (ψ = ~4°)和扁平切割光纖來(lái)刺激和檢測Thy1-ChR2-eYFP小鼠固定腦片不同皮質(zhì)層的熒光，其中EYFP僅限于L2/3和L5(圖3a-c)。我們測量了三種實(shí)驗配置的ξ(x,y)、β(x,y)和ρ(x,y)場(chǎng):靠近淺層的FF(圖3a)、插入L5層的FF(圖3b)和穿過(guò)皮質(zhì)范圍的錐形光纖 (圖3c)。正如預期的那樣，錐形光纖刺激并收集了L2/3和L5層的熒光，而扁平切割光纖在靠近關(guān)節突的一個(gè)有限區域內募集信號，需要重新定位以處理這兩個(gè)區域。此外，光纖纖維鈍的幾何輪廓阻礙了光纖的插入，因為當光纖穿過(guò)切片時(shí)，移位的組織仍然在關(guān)節突的前面。

我們比較了三種實(shí)驗配置產(chǎn)生的絕對信號水平(圖3d)，通過(guò)調制激光功率來(lái)補償錐形光纖的較大光學(xué)活性區域，并在每個(gè)光學(xué)表面提供相同的平均功率密度(~0.1 mW mm-2)。在這些條件下，錐形光纖在兩個(gè)深度都相對于扁平切割光纖產(chǎn)生了更大的熒光信號(圖3e)，這可以解釋為在光收集和光傳輸中分模解復用的綜合作用。在保持中等功率密度的情況下，模式分復用將較高的總照明功率分布在較寬的表面22,27。隨著(zhù)更多的光子被釋放到組織中，更多的神經(jīng)元參與到收集信號中，更多的熒光被產(chǎn)生和檢測到，這與之前的研究結果一致，在較低的輸出功率下錐形光纖比扁平切割光纖更能引起光遺傳激活22。重要的是，由于光漂白依賴(lài)于每個(gè)熒光團的光暴露，當全部的光活性區域被吸收時(shí)，錐形光纖在更大體積的組織上的光分布允許產(chǎn)生更多的熒光而不增加光漂白。

圖4 |體內多點(diǎn)光度法揭示了多巴胺對背側紋狀體和腹側紋狀體運動(dòng)和獎勵的不同反應。a，頂部，用于活體光纖光度測定的手術(shù)部位和兩個(gè)部位錐形光纖照明示意圖。下面是行為室的示意圖。紅色區域表示鼠標需要進(jìn)入盒子的區域來(lái)觸發(fā)容器(藍色)中的食物顆粒的遞送。在獎勵交付后，至少需要30秒的時(shí)間才能交付另一個(gè)獎勵。b，來(lái)自一只老鼠的光度信號示例。上面，行為時(shí)間戳是通過(guò)紅外光束在容器中測出的。青色，獎賞的容器入口;洋紅色，沒(méi)有獎勵的容器入口。中間，動(dòng)物的中心速度。底部，dLight光度信號。紅色，來(lái)自背部的信號;藍色，腹側信號。c，來(lái)自示例小鼠的所有試驗的dLight光度信號的熱圖(兩個(gè)階段)。上方，來(lái)自背部的信號。底部，來(lái)自腹側的信號。每一行代表一個(gè)單獨的試驗。N = 37次獎勵容器進(jìn)入試驗。N = 435例無(wú)獎勵進(jìn)入容器的試驗。N = 52次運動(dòng)啟動(dòng)試驗。d，小鼠所有會(huì )話(huà)的平均速度和dLight光度信號。來(lái)自背部的信號顯示為紅色;來(lái)自腹側的信號顯示為藍色(n = 8次，來(lái)自4只小鼠)。陰影區域代表會(huì )話(huà)平均值的標準誤差。

體內空間分辨光度法

為了更深入地了解構成運動(dòng)行為和獎賞驅動(dòng)行為基礎的神經(jīng)過(guò)程，光纖光度法已被用于探測紋狀體神經(jīng)元的活動(dòng)11-13,29。在這種情況下，錐形光纖通過(guò)使用一個(gè)遠程控制的植入物對多個(gè)區域進(jìn)行采樣來(lái)擴展實(shí)驗能力。為了支持這一論點(diǎn)，我們用紋狀體中的錐形光纖對位點(diǎn)選擇性熒光法進(jìn)行了表征(圖3f)。我們將一個(gè)0.66-NA 錐形光纖插入Thy1-ChR2- EYFP小鼠固定腦片的紋狀體中，在獲得ξ(x,y)場(chǎng)(圖3g)后，我們使用位點(diǎn)選擇性照明來(lái)產(chǎn)生增加輸入角度時(shí)的光度測量效率ρ(x,y)場(chǎng)(補充圖5)。正如預期的那樣，隨著(zhù)光輸入角度的增加，響應位點(diǎn)選擇性照明的體積逐漸遠離錐形光纖jian 端(圖3h)。

我們使用dLight1.1(參考文獻30)同時(shí)測量背側紋狀體和腹側紋狀體的多巴胺瞬變，在體內測試錐形光纖系統，這兩個(gè)腦區顯示出不同的多巴胺信號31。我們在一個(gè)簡(jiǎn)單的操作性條件反射范式中訓練小鼠，在此期間我們從背側和腹側紋狀體收集dLight熒光(圖4a, NA = 0.39)。在這個(gè)實(shí)驗中，老鼠必須待在房間的一邊，才能觸發(fā)食物獎勵從位于房間另一邊的容器中傳遞出來(lái)。這迫使老鼠從房間的一邊跑到另一邊去收集獎勵，并在消耗容器中的獎勵時(shí)停止移動(dòng)。

我們在腹側紋狀體中觀(guān)察到經(jīng)典的獎賞驅動(dòng)的多巴胺瞬變，其中dLight熒光在獎賞受體進(jìn)入期間增加，在無(wú)獎賞進(jìn)入期間減少(圖4b-d;補充圖6所示的所有試驗均為單獨的小鼠)。然而，對于獎賞和未獎賞的受體條目，背側dLight熒光均下降，這表明背側紋狀體中的多巴胺釋放與運動(dòng)變化的相關(guān)性更強，而不是與獎賞的獲得(圖4b-d)。此外，在獎賞受體進(jìn)入時(shí)，背側紋狀體和腹側紋狀體由行為引起的多巴胺變化的跡象相反，并且與多巴胺在運動(dòng)啟動(dòng)中的功能一致32,33，兩個(gè)部位的信號在運動(dòng)啟動(dòng)期間增加(圖4b-d)。因此，雖然背側紋狀體和腹側紋狀體多巴胺瞬變均追蹤運動(dòng)，但只有腹側紋狀體的多巴胺瞬變對獎勵有強烈反應。

帶有微結構錐形光纖的設計集光體積

錐形光纖與環(huán)境界面的大表面允許根據感興趣的區域設計收集量(圖5)。這可以通過(guò)使用微納米制造技術(shù)來(lái)構建光纖的錐度來(lái)實(shí)現，正如在光傳輸中所顯示的那樣25,26,34。在這里，我們展示了:(i)光收集在波導周?chē)囟ń嵌确秶鷥鹊南拗?圖5a-d)， (ii)當光收集被限制在沿錐度的特定點(diǎn)時(shí)，在深層皮質(zhì)層中對細胞體的觀(guān)察(圖5e-l)， (iii)選擇性照明和從兩個(gè)光學(xué)窗口收集，通過(guò)操縱激發(fā)激光束分別解決(圖5m,n)。

為了限制光的收集到波導表面的一半，我們對其對面的高反射鋁層進(jìn)行熱蒸發(fā)(圖5a)。半包被的TF在光學(xué)表面的ξ(x,y)(圖5b)和剖面(圖5c)與未包被的雙探針在形狀和收集到的光子數方面相似。因此，金屬涂層并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性地改變檢測到的信號，這表明幾乎所有進(jìn)入未涂層錐度的光子都經(jīng)歷了介電全內反射，這是由半涂層光纖中的金屬層強迫的。我們將半包被的錐形光纖插入由Thy1啟動(dòng)子控制的表達EYFP的固定腦切片中，在組織中測試了該裝置的側采集特性(圖5c)。我們獲得了一個(gè)雙光子的表熒光圖像和ξ(x,y)場(chǎng)，并發(fā)現盡管在光纖周?chē)籍a(chǎn)生了熒光，但光纖PMT只獲得了在光纖的未涂覆部分附近產(chǎn)生的熒光(圖5d)。

圖5 |用微結構錐形光纖設計集光體積。a，左，半金屬化TF的掃描電子顯微圖(SEM)。右，在pbs -熒光素溶液中，ξ(x,y)場(chǎng)對半涂覆的0.39-NA TF。b， ξ(x,y)場(chǎng)在pbs -熒光素溶液中。等值線(xiàn)分別用白色、黃色和紅色表示每像素5、10和20個(gè)光子(停留時(shí)間3.2µs)。c， ξ(x,y)對于半涂覆錐形光纖(紅色)和未涂覆錐形光纖(藍色)的場(chǎng)分布。d，在固定的腦切片中收集半涂層TF (Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。從左到右:雙光子表熒光，ξ(x,y)場(chǎng)，合并表熒光(品紅)和ξ(x,y)(青色)。比例尺(a-d)， 250µm。e，設置用于表征從光學(xué)窗口的光收集。插圖，正方形窗的SEM顯微圖(W = ~45µm, L = ~ 1250µm)。f，與L和W相比，由采集等值面包圍的pbs -熒光素溶液的采集量分別為zui大采集量的10%、20%、40%、60%、80%(補充圖6)。g，固定腦片(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)的方形窗光采集(W = ~45µm, L = ~750µm);該圖像顯示了ξ(x,y)域(青色)與同時(shí)獲得的雙光子表觀(guān)熒光圖像(品紅)的疊加;比例尺，500µm。插入，放大窗口;比例尺，50µm。h，在光學(xué)窗口上方隨高度增加的Z-stack(0、20、40、60µm)。錐形光纖配置文件和窗口位置用白色表示。比例尺，10µm。i，與g一樣，當TF的時(shí)間窗W = ~20µm時(shí)，L = ~230µm;比例尺，100µm(插圖，10µm)。l，如h，對于W = ~20µm的光學(xué)窗口:高度為0、15、30、50µm的z-stack;比例尺，10µm。m，設置用于選擇地點(diǎn)的照明和收集。錐形光纖被淹沒(méi)在pbs -熒光素滴中。激光束脈沖(10 Hz, 50 ms, 473 nm)在受控θ下注入(補充圖7c)。比例尺，500µm。n，從W1和W2窗口測量的熒光信號，通過(guò)操縱θ獨立激活(熒光信號通過(guò)減去自身熒光校正)。c、d、g-l、n實(shí)驗重復3次，結果相似。

從任意深度的光學(xué)窗口收集光

我們探索了在全鋁涂層的TF上制造光學(xué)窗來(lái)進(jìn)一步限制收集體積的可能性，我們使用聚焦離子束研磨來(lái)選擇性地去除錐形特定區域的金屬25,26。為了優(yōu)化該裝置，我們如上所述對PBS-熒光素溶液(30µM)中光學(xué)窗口的光收集進(jìn)行了表征。我們制作了不同邊長(cháng)(W = 60、30、15µm)的光學(xué)窗平方的探針(NA = 0.39)，放置在距離光纖jian 端不同距離(L = 230、750、1,250µm)處(圖5e、f)。這些設備的體積收集圖(補充圖7a)顯示，較大的窗口導致較大的收集量(圖5f)。然而，盡管靠近jian 端的窗口從略大的體積中收集，但在較大的錐形截面上的窗口具有相似的收集特性(圖5f)。

我們在Thy1-ChR2-EYFP小鼠的固定腦片上，通過(guò)采集ξ(x,y)場(chǎng)與同步外熒光成像相關(guān)聯(lián)，測試了微結構錐形光纖的光學(xué)性能。我們發(fā)現，對于窗寬W = ~45µm，位于距錐尖L = ~750µm的錐形光纖，光集合與光學(xué)窗口位置共定位，其集合葉不垂直于纖維軸，而是指向錐尖(圖5g)。這一特性與來(lái)自光學(xué)窗的選擇性光傳遞密切相關(guān)25，因為它允許在深度上與細胞體積進(jìn)行界面，具有高空間選擇性(圖5h)。此外，從光學(xué)窗口附近的區域獲得的三維熒光堆棧(側W = ~45µm, L = ~750µm)(圖5h和補充圖7b)顯示了光度圖和表觀(guān)熒光成像的精確匹配。我們使用窗口寬度W = ~25µm的錐形光纖得到了類(lèi)似的結果，錐形光纖位于距jian 端L = ~230µm處(圖5i, L)。

正如我們所展示的，對于未涂覆的錐形光纖，可以利用分模解復用策略選擇性地激發(fā)和收集來(lái)自同一錐形光纖不同截面的兩個(gè)光學(xué)窗口的熒光(圖5m和補充圖7c)。為此，我們將微結構錐形光纖浸入熒光素滴中，并在不同的輸入角度注入473 nm的激光束，以每次選擇一個(gè)窗口(補充圖7c)。我們用聲光調制器(10 Hz, 50%占空比方波)調制激光功率時(shí)，用光電探測器測量采集到的熒光信號(圖5n)。熒光在每個(gè)窗口位置被選擇性激發(fā)，表明錐形光纖可以選擇性地照亮和收集來(lái)自?xún)蓚€(gè)受限區域的光(圖5m,n和補充圖7c)。

圖6 |利用遠場(chǎng)成像進(jìn)行深度分辨光纖測光的檢測方案。a、遠場(chǎng)檢測熒光支持時(shí)分復用，提高深度選擇性。b，通過(guò)全NA刺激實(shí)現遠場(chǎng)檢測，實(shí)現基于反向傳播熒光的kT值的純分模解復用。Fluo，熒光信號;Exc，激發(fā)光。

討論

在神經(jīng)科學(xué)中，從大腦中表達的活動(dòng)指示器獲取熒光信號是一項強大的技術(shù)35,36，可植入式波導系統將極大地造福神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，該系統可配置為有效和選擇性地收集感興趣區域的光。此外，本文中提出的方法可以在使用遠場(chǎng)檢測來(lái)獲得光纖光度實(shí)驗中的深度選擇性方面打開(kāi)進(jìn)一步的視角(圖6)。

我們設想應用錐形光纖探針從散射組織中收集熒光，將有助于解剖腦深部多個(gè)功能區的貢獻，同時(shí)為現有的光學(xué)方法提供一個(gè)通用的補充?；阱F形光纖的分模解復用的光度測定方法也可以潛在地擴展到大類(lèi)別的軟的、生物的、活組織，其中大腦代表了散射特性方面具挑戰性的情況之一，考慮到散射長(cháng)度和各向異性。在這個(gè)框架中，錐形光纖為現有的光收集設備增加了有益的功能，使用了扁平切割光纖或µLED/光電探測器系統無(wú)法實(shí)現的不同配置10。

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