從實(shí)驗室到生產(chǎn)線(xiàn)：固態(tài)光源技術(shù)在生物成像與工業(yè)檢測中的性能提升

生物醫學(xué)成像和工業(yè)計量的照明系統規格通常集中在光譜、空間和時(shí)間的光輸出特性上。Lumencor的技術(shù)支持總監Iain Johnson和我們分享了固態(tài)光源陣列——LED、發(fā)光管和激光器組合成的固態(tài)光引擎如何實(shí)現規格定制，以滿(mǎn)足特定應用的照明要求。

固態(tài)光引擎是一個(gè)集中控制的固態(tài)光源陣列，其輸出合并到一個(gè)共同的光學(xué)傳輸系統中（圖1）。光源的輸出可以并行激活以產(chǎn)生白光（圖2），或在需要分離的波長(cháng)時(shí)，也可按順序進(jìn)行激活（圖3、圖4）。光源本身可以采用一種固態(tài)照明技術(shù)，即LED、光導管或半導體激光器，也可以對這些光源技術(shù)進(jìn)行組合。這可以根據zui終用戶(hù)的應用對亮度、角度分布和輻照度的要求進(jìn)行定制。根據這一定義，光引擎輸出的光譜分布可以通過(guò)加法組合，而這與傳統的寬光譜照明設備（電弧放電和白熾燈）形成鮮明對比。傳統的照明設備產(chǎn)生的光譜分布在物理上是不變的，只能通過(guò)選擇性的阻擋和衰減來(lái)調整。從工程學(xué)的角度來(lái)看，固態(tài)光源的第二個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，它的輸出可以在強度（圖2、圖4）和時(shí)間（圖4、圖5）方面進(jìn)行精確控制。因此，光譜輸出單元件的差異很?。▓D2），這使得光引擎應用于不同成像系統時(shí)，所獲得的數據質(zhì)量能保持一致。

圖1.固態(tài)光引擎及其輸出光譜的概念圖。四個(gè)固態(tài)光源的輸出被合并入一個(gè)共同的光路，并通過(guò)光導耦合進(jìn)入纖維及或者圖像掃描儀。在實(shí)際操作中，光源可以是2-21個(gè)，具體數量取決于應用要求。光源可以是LED、光導管或半導體激光器其中的一種或組合。它們的輸出可以經(jīng)過(guò)濾波（F）以細化光譜。輸出光的一部分會(huì )被分離出來(lái)，并導向參考光電二極管（rPD），以提供控制反饋。

在大多數生物醫學(xué)成像應用中，不需要持續照明，甚至在某些情況下，會(huì )起到反效果，影響實(shí)驗數據。通常情況下，照明與相機曝光會(huì )同步進(jìn)行。這里有兩個(gè)重點(diǎn)：首先是光源間的切換速度，其次是脈沖間隔的復現性。相比和機械濾光輪耦合的白光照明器（約50ms的切換時(shí)間），光引擎可以做到小于1ms的光源間切換（圖4），縮短了獲取多色圖像Z軸堆疊或者玻片掃描所需的時(shí)間。脈沖間的積分不變形（圖5）是決定延時(shí)圖像序列保真度的關(guān)鍵因素。每個(gè)脈沖的積分量化了在延時(shí)序列中每次曝光所需的照度。脈沖之間的照度差異越小，樣品動(dòng)態(tài)行為的敏感度就越能增加，這在圖像幀到幀的變化間可以體現。

圖2.28臺SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出曲線(xiàn)疊加。光引擎的總光輸出由光譜曲線(xiàn)所包圍的區域來(lái)量化。所有28臺光引擎的平均輸出功率為4558mW，標準差（n=28）為91mW，相當于2%的方差系數（CV）。

圖3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出，包括LED、發(fā)光管或激光器。發(fā)光二極管和光導管的波長(cháng)規格（nm）代表了中心波長(cháng)（CWL）/半高全寬（FWHM），已經(jīng)通過(guò)內置的濾光片來(lái)改進(jìn)光源輸出。功率（mW）是在光導（連接到顯微鏡或光學(xué)掃描儀）的遠端測量得到的。

集成三種不同類(lèi)型的固態(tài)光源，可以在整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外波段內提供均勻的功率輸出。

圖4.由TTL觸發(fā)，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替輸出485nm（約0.5ms寬）和560nm（約3ms寬）的脈沖（示波器記錄）。圖中顯示了兩條疊加的示波器軌跡，其中485nm的強度通過(guò)RS232串行命令從100%調整到55%，而560nm的強度保持不變。485nm和560nm的脈沖時(shí)間間隔為0.25ms。

圖5.模擬光電二極管（APD）檢測來(lái)自一臺5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）發(fā)出的5ms光脈沖。圖中展示了10個(gè)脈沖序列，代表了每次數據采集中記錄的150個(gè)連續脈沖。計算了150個(gè)脈沖序列中每個(gè)脈沖的積分光輸出。對于555/28 nm輸出，150個(gè)脈沖的方差系數（CV）在555/28 nm脈沖串中為0.23%，在635/22 nm脈沖序列中為0.20%。其他三個(gè)源通道的CV值相似（0.15-0.25%）。

除了光譜帶寬（圖3）以外，固態(tài)LED、光導管和激光器之間的主要區別在于其光輸出的角度分布；LED和激光器之前的zui大區別如表1所示。對于寬場(chǎng)顯微鏡應用，LED光源配置為科勒照明產(chǎn)生的均勻照明，輻照度范圍為1-100mW/mm2。然而，單分子定位顯微鏡（SMLM）需要更高的輻照度，通過(guò)鏈接到顯微鏡臨界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），可以在樣品表明提供10^4mW/mm2的輻照度（圖6）。臨界照明的使用是由科勒照明在光學(xué)上的低效率所決定的，因為科勒照明并沒(méi)有覆蓋整個(gè)光源表面或者發(fā)射光的全部角度分布。在臨界照明中，光源被直接成像到樣品平面上，這種方法更為高效，但對光源輸出中的任何空間不均勻性也更為敏感。臨界落射照明器的作用是均勻化任何空間上的不均勻性，以產(chǎn)生與典型scmos相機傳感器尺寸（~200mm2）相匹配的高輻照度照明場(chǎng)。

表1. 光源比較

①輸出功率是在zhi定光導的遠端測量的

②使用光導將光源輸出耦合到顯微鏡或光學(xué)掃描儀

③光導的數值孔徑

④光通量積決定了光學(xué)檢測系統有效利用光源輸出的能力。當光源的光通量積與光學(xué)系統的光通量積緊密匹配時(shí)，可以獲得很好的性能。sr=球面弧度。

針對光驅動(dòng)生物技術(shù)以及工業(yè)應用，優(yōu)化光源的選擇性需要全面考慮儀器的光譜、空間和時(shí)間要求，這些正是需要照明光源來(lái)支持的。通常一種技術(shù)盡可以滿(mǎn)足其中的部分要求，所以策略即是混合多種技術(shù)來(lái)滿(mǎn)足全部需求。復雜的光引擎可以提供這樣一種集成的方法來(lái)混合光源，并克服任何給定技術(shù)的基本限制，例如，在熒光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著(zhù)的“綠色間隙"功率和亮度往往無(wú)法滿(mǎn)足；或者相對于毫秒級的切換時(shí)間，任何弧光燈的開(kāi)/關(guān)不穩定性；又或者廣譜光源進(jìn)行多路復用研究時(shí)，譜寬也帶來(lái)了限制。如今各種固態(tài)光源各有優(yōu)劣，只有仔細評估它們的優(yōu)點(diǎn)與局限性，才能為光驅動(dòng)生命和材料科學(xué)應用的廣泛領(lǐng)域找到zui合適的照面解決方案。

圖6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通過(guò)一根直徑800um的光纖耦合到安裝在尼康Ti/Ti2顯微鏡的臨界落射照明器上，并產(chǎn)生均勻的熒光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相機進(jìn)行圖像捕捉。圖表顯示了相機沿著(zhù)標記為紅色的對角線(xiàn)所記錄的灰度值。右上角的插圖展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的同一樣品。

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