固態(tài)照明技術(shù)革新多路復用熒光檢測

長(cháng)久以來(lái)，在復雜、異質(zhì)的樣品中同時(shí)識別以及定位多個(gè)分子或者分子組裝的能力一直是推動(dòng)熒光顯微鏡在生物和物理科學(xué)研究中應用的主要特性。例如，自1986年以來(lái)，使用四種光譜上的不同熒光團來(lái)識別DNA中的腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鳥(niǎo)嘌呤（G）堿基，這一直是大多數自動(dòng)化DNA測序技術(shù)的基礎。然而，對大規模生物系統的基因組和轉錄組的研究可能需要同時(shí)識別和定位成百上千的分子標靶。這種高度并行的分析超出了基于光譜鑒別的多路復用能力。Lumencor分析了基于光譜鑒別的多路復用熒光檢測的局限性，以及為擴大可檢測標靶數量而引入的一些固態(tài)光源新技術(shù)。

光譜鑒別的局限性

大多數多路復用檢測方案都基于光譜鑒別，因為與基于時(shí)間或空間鑒別方法相比，它的技術(shù)復雜性較低，成本也較低。然而由于光譜串擾，光譜的鑒別方法范圍僅限于大約5個(gè)目標（圖1和圖2）。這種局限性主要是由于用于雙分子標記的熒光染料和熒光蛋白（FP）的光譜特性，如圖1 所示。在此示例中，雖然只有兩個(gè)熒光標記，但它們的激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)跨越了整個(gè)可見(jiàn)光波長(cháng)范圍（400-700nm），并且具有明顯的光譜重疊，會(huì )導致光譜分離不wan 全。如果以485nm左右的光進(jìn)行激發(fā)（灰色部分），兩種熒光團會(huì )被同時(shí)激發(fā)。只有波長(cháng)大于550nm時(shí)才能選擇性地激發(fā)其中的一種，從而獲得光譜鑒別。

圖1. Alexa Flour488和Alexa Fluor 555熒光染料的歸一化熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。發(fā)射光譜的重疊區域由綠色陰影表示?；疑幱皡^域表示圖2中用于采集圖像A-C的激發(fā)帶寬（475/28nm）。

針對串擾的問(wèn)題，雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)出具有窄發(fā)射光譜的量子點(diǎn)納米晶體，可以提供更好的分離光譜。但與有機染料相比，這種改進(jìn)的代價(jià)是熒光團尺寸增加了一個(gè)數量級以上，這反過(guò)來(lái)又阻礙了它們在雙分子標記應用中的應用。

Lumencor的固態(tài)光引擎優(yōu)化了輸出光譜，提供了多個(gè)窄線(xiàn)寬的光源，盡可能實(shí)現對特定熒光染料的精確激發(fā)，而這對于多重熒光檢測至關(guān)重要，可以有效減小光譜串擾問(wèn)題的發(fā)生。下圖中是使用Lumencor SPECTRA光引擎、Andor Zyla 5.5 scmos相機和Nikon Ti2顯微鏡對麂皮成纖維細胞進(jìn)行成像?？梢钥吹接捎诩ぐl(fā)光帶寬（555/28 nm）與Alexa Fluor 488的激發(fā)光譜沒(méi)有顯著(zhù)交叉，因此圖像沒(méi)有因串擾而退化。

圖2. 四張60倍熒光圖像，展示了同一視野下的麂皮成纖維細胞。用Alexa Fluor 488 phalloidin (actin)以及mouse anti–OxPhos Complex V + Alexa Fluor 555 goat anti–mouse IgG (mitochondria)進(jìn)行標記。

A.使用單波段激光和發(fā)散濾光片以及單波段的二色分光鏡來(lái)獲得的肌動(dòng)蛋白細胞骨架的圖像。

B.使用單波段激發(fā)和發(fā)射濾光片以及多波段段二色分光鏡來(lái)獲得的等效肌動(dòng)蛋白細胞骨架圖像。

C.由于光譜串擾導致線(xiàn)粒體檢測時(shí)肌動(dòng)蛋白細胞骨架圖像退化。圖像使用單波段激發(fā)濾光片、多波段二色分光鏡和多波段的發(fā)射濾光片獲得。

D.使用單波段激發(fā)濾光片、多波段二色分光鏡和多波段發(fā)射濾光片獲得的線(xiàn)粒體圖像。

多重熒光成像的突破

好馬配好鞍，為了充分利用 Lumencor 光源的you秀性能，科研人員正在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和優(yōu)化用于多路復用熒光檢測的方案。

優(yōu)化的光學(xué)濾光片和解混算法

來(lái)自美國guo家神經(jīng)系統疾病和卒中研究所的一篇Nature論文中有為解決多重熒光成像的熒光串擾問(wèn)題提供了一些新策略。為了理解大腦中健康和病理生理過(guò)沖需要對多個(gè)組織樣本進(jìn)行大量的組織學(xué)觀(guān)察，以表征所有主要的腦細胞類(lèi)型。為了實(shí)現大規模多重免疫熒光成像技術(shù)，以實(shí)現多達10種不同熒光標記物的同時(shí)成像，從硬件上，他們優(yōu)化了濾光片的組合，使用了10組自定義的激發(fā)/二向色/發(fā)射濾光片組合，這些精心挑選的濾光片被優(yōu)化用于迭代成像不同的光譜兼容的熒光標記物，以確保在成像光譜范圍內具有min的光譜串擾。而從軟件上，本文中也開(kāi)發(fā)了多種算法以從復雜的腦組織樣本中提取出豐富和準確的生物學(xué)信息，主要是一種半監督稀疏線(xiàn)性光譜解混算法，校正原始熒光圖像數據的串擾和非特異性標記，提高了信號分離的準確性。

Lumencor固態(tài)光引擎SPECTRA的光譜輸出針對本方案中使用的熒光染料面板的選擇性激發(fā)進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示。光引擎集成了 LED、光管和激光器，以實(shí)現所需的光譜激發(fā)分布和所需的光功率。使用相同的熒光染料組合和濾光片配置，通過(guò)連續的剝離、重新標記和成像輪次，可以增加多重檢測的程度。通過(guò)5個(gè)周期的剝離、10倍多重標記和成像，已證明可以在大鼠大腦冠狀切片中同時(shí)定位50個(gè)生物標記靶標。

圖3. SPECTRA光引擎的光譜輸出經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可選擇性激發(fā)用于10倍免疫熒光檢測的熒光染料。

參考文獻：

D Maric, J Jahanipour, B Roysam et al., Whole-brain tissue mapping toolkit using large-scale highly multiplexed immunofluorescence imaging and deep neural networks. Nature Communications (2021)12:1550

MERFISH技術(shù)

通過(guò)在基于光譜鑒別的多路復用技術(shù)中添加空間和時(shí)間維度，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出能夠同時(shí)識別和定位數百和數千個(gè)生物分子標靶的多路復用技術(shù)。而用于基因表達分析的分子條形碼掃描就是這樣一種技術(shù)，利用核酸雜交來(lái)識別DNA和RNA分子標靶，并將其作為產(chǎn)生熒光染料順序排列的模版。

圖4. 用于基因表達分析的分子條形碼掃描。掃描儀配有激發(fā)和發(fā)射濾光片，可區分由藍色、綠色、黃色和紅色圓圈代表的 4 種染料，可讀取探針位置 1 至 6 的熒光信號，以揭示雜交核酸靶標的編碼身份。

以分子條形碼掃描為出發(fā)點(diǎn)的MERFISH (多重誤差魯棒熒光原位雜交)是一種高度多重化的單分子成像技術(shù)，能夠同時(shí)測量單個(gè)細胞中數百至數千個(gè)目標 RNA 種類(lèi)的拷貝數和空間分布。首先將編碼的寡核苷酸探針和目標RNA雜交，并依次添加熒光染料標記的讀取核苷酸探針。這些讀取探針會(huì )在單分子級別上被空間定位，然后被熄滅。讀取探針必須僅與編碼探針雜交，而不能與細胞核酸發(fā)生雜交。通過(guò)連續的成像周期積累編碼探針的身份，如果編碼探針通過(guò)讀取探針的雜交被檢測到，則賦予二進(jìn)制位值“1"，如果沒(méi)有檢測到，則賦予“0"。原則上，需要 12 個(gè)雜交+成像周期來(lái)識別 4095（212-1）個(gè)的編碼探針。實(shí)際上，二進(jìn)制編碼空間較少，以盡量減少假陰性（1>0）和假陽(yáng)性（0>1）調用錯誤以及隨之而來(lái)的靶標 RNA 錯誤識別。例如，已經(jīng)證明可以使用 69 位條形碼識別 10,050 個(gè) RNA 靶標。

對于MERFISH應用，需要高強度、空間均勻的照明場(chǎng)，并且與典型scmos相機傳感器的尺寸（~200mm2）相匹配。為了滿(mǎn)足此要求，需要在顯微鏡中安裝專(zhuān)業(yè)的臨界照明器。Lumencor的CELESTA光引擎很好地滿(mǎn)足了這些需求，通過(guò)光纖輸出耦合到顯微鏡中，通過(guò)高數值孔徑的高放大倍數物鏡在樣品平面上提供1-10W/mm2。

圖5. 為MERFISH多路單分子成像優(yōu)化的CELESTA激光光引擎輸出光譜。

顯然，對于那些超出簡(jiǎn)單光譜分辨能力的高并行熒光標記生物分析，可以通過(guò)精心選擇熒光團、光學(xué)濾光片、精細調節激發(fā)照明和智能算法來(lái)實(shí)現。巧妙的標記策略，如分子條形碼，也可以應用于廣泛的生物樣本，以增強來(lái)自高度復雜組織標本的生物分子信息的光譜分辨和空間分布。在此，我們講述了一種大規模并行單分子成像技術(shù)，MERFISH，利用重復標記協(xié)議來(lái)max化單細胞中數十萬(wàn)個(gè)RNA靶標的拷貝數量和空間分布信息。檢索大量數據集的技術(shù)和機會(huì )對于當今豐富的基因組和轉錄組信息生物分析至關(guān)重要。實(shí)驗者必須在有限的波長(cháng)范圍內進(jìn)行光譜解析，以充分利用光譜寬度、光譜純度和熒光團兼容性，以實(shí)現激發(fā)和發(fā)射之間的很好區分。策略性的重復成像，輔以純凈、明亮、穩定的照明和高質(zhì)量的光學(xué)玻璃，能夠實(shí)現高度多重化的結果，并克服了在可用可見(jiàn)波長(cháng)內定義的歷史限制。

參考文獻

C Xia, J Fan, G Emanuel, J Hao, X Zhuang et al., Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression Proc Natl Acad Sci U S A (2019) 116:19490–19499

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